Sequencing by Hybridization Aluno: Ennio Baptista Orientadora: Kátia Guimarães

Apresentação em tema: "Sequencing by Hybridization Aluno: Ennio Baptista Orientadora: Kátia Guimarães"— Transcrição da apresentação:

1 Sequencing by Hybridization Aluno: Ennio Baptista (esb@cin.ufpe.br)esb@cin.ufpe.br Orientadora: Kátia Guimarães (katia@cin.ufpe.br)katia@cin.ufpe.br

2 2 Sequenciamento de DNA Objetivo : determinar a estrutura de uma molécula de DNA, identificando A SEQÜÊNCIA DE nucleotídeos componentes. É o primeiro passo para a interpretação das informações genéticas codificadas no DNA, as quais determinam as características estruturais e funcionais de cada ser vivo 

3 3 Técnicas de Seqüenciamento Overlap-layout-consensus : nos últimos 20 anos apresentou melhor resultado (CAP3, Phrap,TIGR) 1)é difícil obter as informações corretas sobre a sobreposição dos fragmentos 2)é difícil encontrar o caminho correto num grafo de overlap com muitas arestas falsas 

4 4 Técnicas de Seqüenciamento Abordagem Alternativa : Em 1988, 4 grupos de pesquisas propuseram como alternativa uma nova técnica de seqüenciamento de DNA denominada Sequencing by Hybridization (SBH) Bains and Smith (1988) Drmanac et al., 1989 Lysov et al., 1988 Southern, 1988 Custo, velocidade, automação e eficiência 

5 5 SBH : Princípios Duas etapas complementares bem definidas : 1.Etapa Bioquímica :Etapa Bioquímica : 2.Etapa Computacional :Etapa Computacional 

6 6 SBH : Etapa Bioquímica Etapa experimental em que o spectrum da seqüência é identificado :spectrum 1)Todos os probes de tamanho ℓ são fixados em posições conhecidas na superfície do DNA chip ou microarray : C(ℓ)  4 ℓ probesprobes DNA chip microarray 2)O DNA chip é colocado em contato com uma solução contendo cópias da cadeia de DNA marcadas por fluorescência 

7 7 SBH : Etapa Bioquímica 3)O DNA chip é lavado e as cópias que tiverem hibridizado com algum de seus probes permanecem ligadas à sua superfície. probes 4)Um procedimento de leitura revela as posições onde ocorreram as hibridizações  o spectrum é determinadospectrum 

8 8 SBH : Etapa Bioquímica EXEMPLO – DNA Chip C (4) DNA target : TATCCGTTT  Spectrum = {ATAG, AGGC, TAGG, GGCA, CAAA, GCAA}

9 9 SBH : Etapa Combinatorial Etapa computacional para descobrir o posicionamento de cada um dos probes A reconstrução de uma cadeia original, a partir do seu spectrum, só é possível graças a uma característica peculiar de formação do spectrum, que garante que todos os ℓ-1 nucleotídeos finais de uma ℓ-tupla se sobrepõem aos ℓ-1 nucleotídeos iniciais da ℓ-tupla seguinte. 

10 10 SBH : Etapa Combinatorial  TATCCGTTT ||||||||| ATAGGCAAA ATAG TAGG AGGC GGCA GCAA CAAA EXEMPLO – Sequenciamento DNA target : TATCCGTTT Spectrum = {ATAG, AGGC, TAGG, GGCA, CAAA, GCAA}

11 11 SBH  Shortest Superstring Problem (SSP) SSP  Traveling Salesman Problem o Grafo dirigido completo tendo os Vértices associados às ℓ-tuplas, e as arestas, às sobreposições Spectrum S  grafo G(V,A) SBH : Etapa Combinatorial 

12 12 Spectrum S  grafo G(V,A) SBH : Etapa Combinatorial  S : resultado do experimento bioquímico G : grafo dirigido completo V = {ℓ-tuplas do spectrum S} A = {(p,q) : p e q se sobrepõem por ℓ-1 caracteres}

13 13 SBH : Etapa Combinatorial  EXEMPLO SBH e o Caminho Hamiltoniano S = {ATG, AGG, TGC, TCC, GTC, GGT, GCA, CAG} G ATG  TGC  GCA  CAG  AGG  GGT  GTC  TCC

14 14 SBH : Etapa Combinatorial  “Existe uma correspondência de um para um entre caminhos que visitam cada vértice de G e fragmentos de DNA com o spectrum S” O Caminho Hamiltoniano dá a seqüência, mas nenhum algoritmo eficiente é conhecido (NP- completo)NP- completo

15 15 SBH : Outras Abordagens  Em 1989, Pevzner propõe uma solução de tempo linear. Um grafo em que cada aresta representa uma ℓ-tupla, e cada vértice uma (ℓ-1)- tupla, sendo que cada (ℓ-1)-tupla v é incidente a uma (ℓ-1)-tupla w, se existir no spectrum uma ℓ-tupla com seus ℓ-1 nucleotídeos iniciais coincidindo com v, e seus ℓ-1 nucleotídeos finais coincidem com w

16 16 S = {ATG,TGG,TGC,GTG,GGC,GCA,GCG,CGT} GT CG AT TG GC CA GG SBH : Outras Abordagens  EXEMPLO – Grafo proposto por Pevzner

17 17 O Caminho Euleriano dá a seqüência em tempo polinomial, mas tem limitações :Caminho Euleriano Erros de experimentação Erros de experimentação Repetições de ℓ-tuplas Repetições de ℓ-tuplas Branching Vertex Branching Vertex Construções Ambíguas SBH : Outras Abordagens 

18 18 S = {ATG,TGG,***,GTG,GGC,GCA,GCG,***} GT CG AT TG GC CA GG SBH : Outras Abordagens  Construções Ambíguas : Erros

19 19 SBH : Outras Abordagens  Construções Ambíguas : Erros S = {ATG,TGG,***,GTG,GGC,GCA,GCG,***} GT CG AT TG GC CA GG

20 20 SBH : Outras Abordagens  Construções Ambíguas : Branching Vertex S = {ATG,TGG,TGC,GTG,GGC,GCA,GCG,CGT} GT CG AT TG GC CA GG S = {ATG,TGG,TGC,GTG,GGC,GCA,GCG,CGT} GT CG AT TG GC CA GG

21 21 SBH : Outras Abordagens  S = {ATG,TGG,TGC,GTG,GGC,GCA,GCG,CGT} GT CG AT TG GC CA GG S = {ATG,TGG,TGC,GTG,GGC,GCA,GCG,CGT} GT CG AT TG GC CA GG Construções Ambíguas : Branching Vertex

22 22 SBH : Ficam algumas perguntas  “Qual a probabilidade de um fragmento de DNA de tamanho n ser reconstruído, sem ambigüidade, por um DNA array C(ℓ) ?” “Qual deve ser o tamanho de ℓ para reconstruir, sem ambigüidade, uma seqüência de tamanho n a partir de seu spectrum ?”

23 23 SBH : Outras Abordagens  Como superar o problema da reconstrução de seqüências ambíguas ? 1)projetos de chips alternativos (alternative chip designs) 2) protocolos interativos (interative protocols) 3) usar informação de localização (using location information) 4) usar uma seqüência homóloga conhecida (using a known homologus sequence). (Pe’er, 2000:260)