Introdução: Aproximadamente um terço da população mundial está infectada por M. tuberculosis. 9 milhões de novos casos por ano. 1,8 milhões de mortes por.

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2 Introdução: Aproximadamente um terço da população mundial está infectada por M. tuberculosis. 9 milhões de novos casos por ano. 1,8 milhões de mortes por ano.

3 Introdução: Por que a procura de antígenos novos são importantes?
Produção de reagentes para diagnóstico e novas vacinas. PPD

4 Introdução: O genoma do M. tuberculosis possui 16 regiões do genoma deletadas em outras Mycobactérias (utilizadas para BCG, por exemplo)

5 Introdução: Rv3874 Rv3875 Rv3619c O que se tinha? O que foi feito:
Overlaping (peptídeos sintéticos) In vitro (ativação de linfócitos T) Rv3874 Rv3875 Rv3619c Proteína inteira In vivo O que foi feito:

6 Clonagem: Amplificação: PCR DNA M. tuberculosis Iniciadores dNTPs
Enzima + Tampão Purificação Ligação

7 Ligação: vetor de clonagem univeral
Transformação: Choque térmico

8 Outras técnicas de transformação:
Genegun Eletroporação Vírus

9 Seleção das culturas: Ampicilina
Outras técnicas de seleção: Bioluminescência Azul/branco

10 Restrição enzimática: BamHI e Hind III
Ligação no vetor de expressão:

11 Inseriram a sequencia para cauda de histidina no pGEX
Vantagem: duplo sistema de purificação

12 Expressão: Transformação: Choque térmico Seleção das colônias
Sequenciamento Expressão: IPTG

13 Purificação: Resina, para retirar a GST +
Coluna de Ni, para retirar a cauda de Histidina

14 Purificação:

15 Western Blotting: Anticorpo: anti- GST Anticorpo: anti- His

16 Imunização: Rv3874 Rv3875 Rv3619c + Adjuvante de Freud
2 apresentações com 2 semanas de intervalo Após 2 semanas retira-se o soro

17 Elisa:

18 Resposta Imune celular:
Linfócito B

19 Epítopos lineares: ABCPred Predition server
Proteínas também geraram epítopos lineares, assim como os peptídeos, na imunização

20 Conclusões: O vetor construído e a dupla purificação são eficientes As proteínas são imunogênicas nos coelhos Questionamento: Qual a vantagem da produção da proteína recombinante para a resposta imune em coelhos?