Aplicações da Proteômica em diversas linhas de pesquisa na área Biomédica www.bioinfo.ufrj.br/proteoma/

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1 Aplicações da Proteômica em diversas linhas de pesquisa na área Biomédica

2 Proteoma ou Proteômica
Definição: Análise simultânea de misturas complexas de proteínas como extratos de lisados celulares ou de tecidos, assim como fluidos biológicos, visando a identificação e/ou medir as mudanças do nível de expressão de proteínas em diferentes condições fisiológicas e/ou patológicas. Conjunto das proteínas expressas por uma célula é bastante dinâmico e dependerá das condições particulares/ ou do momento fisio/patológico da mesma.

3 Aplicações: Estudos em patologia, - Diagnóstico, Terapias,
Descoberta de novas drogas, Estudos em patologia, - Diagnóstico, Terapias, Microbiologia, Bioquímica, Fisiologia de plantas, Controle de qualidade.

4 Esquema geral de identificação de proteínas

5 Genômica x Proteômica A Genômica possibilitou o sequenciamento de alta performance de diferentes gens de diversos organismos. Porém não resolveu questões importantes relativo á função de várias proteínas. “Podemos ver o Genoma como a descoberta dos hieróglifos que ainda necessitam ser decifrados”

6 Histórico do sequenciamento de genomas
1977- bacteriófago phi-x174 (5386bp) foi 1. organismo sequenciado. Sanger et al [Nature 246, 687 (1977)]. 1982- bacteriophage lambda (48,502bp) Sanger et al [J. Mol. Biol. 162, 729 (1982)] anos 80 - genoma mitocondrial, 16kb; Epstein Barr virus, 172kb; human cytomegalovirus, 229kb 1980’s- final: desenvolvimento de sequenciadores automáticos 1991- menos de 2,000 gens de proteinas humanas conhecidos o. genoma de um organismo de vida livre 1995 bactéria Haemophilus influenzae Rd KW20- 1,8 Mbases

7 2004 – 160 genomas bacterianos completos, de 130 espécies
19 genomas de archae completos 28 genomas de eucariotos, completos, ou alguns cromossomas completos cromossomas completos, incluindo: homem camundongo (rato sendo sequenciado) 3 plantas: Arabidopsis thaliana e 2 variedades de arroz 2 peixes 6 protozoários 3 artrópodos incluindo Drosophila melanogaster 6 fungos nematódios, alga, cryptomonas

8 Dados sobre composição do genoma: grande extensão de introns x exons
Gen humano típico: ou 6 introns, tamanho médio dos introns: 2100bp (alguns com bp) tamanho médio dos exons: 125bp Exons de gens celulares: 5% genoma humano

9 Dados sobre composição do genoma: tamanho e número de gens
Homem: gens 2,8 x 109 bp Arroz (Oryza sativa): gens 3,7 x 108 bp Drosophila melanogaster: gens 1,8 x 108 bp Escherichia coli: gens 4,6 x 106 bp Comparando Homem e E. coli tem-se que: número de gens: 5,7x tamanho do DNA: 610 x

10 Um gen  vários produtos !
questão 1: 1 transcrito primário podendo corresponder a mais de um mRNA, e portanto mais de uma proteina questão 2: 1 mRNA não sendo eficientemente traduzido, como ocorre em alguns casos de transferência lateral questão 3: alguns RNAs ficam longo tempo sem ser traduzidos em células eucarióticas questão 4: processamento pós-traducional: várias proteinas, com atividade distinta, vindo do mesmo gen

11 Sequência - Forma - Função
Pos-Genômica Genomica Funcional Genomica Estrutural Proteômica DNA-Microarray Gel Electroforese 2D Espectrometria de Massa Sequenciamento de Proteina Crystallografia de X Ray NMR Sequência - Forma - Função

12 Rede Proteômica Problemas Biológicos Gel 2D Cromatografia Gel 2D
Maldi - Tof Bioinformatica Maldi - Tof MS-MS: ESI-Q-Tof MALDI TOF-TOF Microarray Expressão Cristalização Purificação de Proteína NMR X- rays

13 Abordagens em Proteômica
Proteômica de Expressão Expressão Diferencial Proteômica Funcional Interação Proteina-Proteina Vias de Sinalização Modificação Pós- traducional Proteômica Quantitativa

14 UNIDADES DE EXPRESSÃO, PURIFICAÇÃO E CRISTALIZAÇÃO DE PROTEÍNAS
UFP UFP UFP UFP UFP UFP UFP UEM-MALDI-TOF UEM-MS-MS UEM-MALDI-TOF Bioinformática UNIDADES DE EXPRESSÃO, PURIFICAÇÃO E CRISTALIZAÇÃO DE PROTEÍNAS IDENTIFICAÇÃO

15 Unidades de Fracionamento e Identificação
1) Departamento de Bioquímica Médica - ICB-UFRJ - Russolina Benedeta Zingali 2) Unidade Multidisciplinar de Genômica - IBCCF - UFRJ - Paulo Mascarello Bisch 3) Departamento de Bioquímica, Instituto de Química, UFRJ - Gilberto Domont 4) Instituto Oswaldo Cruz / FIOCRUZ - Jonas Perales 5) Universidade Norte Fluminense - Elias W. Alves Laboratorios Associados 1) Unidade de Apoio em Espectrometria de Massa - Departamento de Física - PUC/RJ - Enio Frota da Silveira 2) Unidade de Apoio de Genômica Estrutural - Centro Nacional de Ressonância Magnética Nuclear de Macromoléculas - ICB/UFRJ - Jerson Lima Silva 3) Laboratório Associado - Agrobiologia - EMBRAPA - RJ - José Ivo Baldani

16 PROJECTOS : 1. Proteômica de toxinas animais : Jonas Perales (FIOCRUZ), Gilberto Domont, (DQ-IQ/UFRJ), Russolina Benedeta Zingali (DBM/ICB/UFRJ), Elias W. Alves (UENF) 2. Expression Proteomics of Vibrio cholerae : Wanda Maria Almeida von Krüger, Ana Beatriz Furlanetto Pacheco (UMGe/IBCCF/UFRJ), Ana Coelho (DG/IB/UFRJ) 3. Proteomics of viral infection ( dengue virus): Mônica Montero Lomeli, Andréa Thompson Da Poian, Russolina Benedeta Zingali, (DBM/ICB/UFRJ) 4. Proteome analysis of Gluconacetobacter diazotrophicus : Elias W. Alves (UENF), José Ivo Baldani, Kátia Regina dos Santos Teixeira, (EMBRAPA/RJ), Paulo Ferreira, Adriana Hemerly (DBM/UFRJ)

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18 Bothrops insularis snake venom proteins identified by peptide mass fingerprinting after 2D SDS-PAGE
Objetivo: caracterização das proteínas presentes no veneno para identificação de novos princípios ativos. Metodologia: separação por 2-D identificação de proteínas por Mapa peptídico e por sequenciamento TOF-TOF

19 (Busca a partir dos dados da biblioteca de cDNA e ESTs do Dr
(Busca a partir dos dados da biblioteca de cDNA e ESTs do Dr. Paulo Lee Ho´s) kDa 94,0- 67,0- 43,0- 30,0- 20.1 - 14.4 - 494 detected spots

20 GEL MASTER Bothrops insularis Spot 489 Lectin Spot 434 Lectin like c-type Spot 394 PLA2 Spot 433, 427, 429 Spot 459

21 Spot 489 Lectin

22 Serine proteinase B. insularis
94,0- 67,0- 43,0- 30,0- 20.1- 14.4- kDa 4 7 Spot 258 Serine proteinase B. insularis Spot 474 Vascular endothelial growth factor Spot 428 Convulxin beta [Crotalus durissus] Spot 427, 429 e 467 Lectin [Bitis arietans] Spot 375, 435 e 459 Platelet glycoprotein Ib-binding protein alpha subunit [B. jararaca] Spots 255, 260, 261, 262 and 268 Metalloproteinase (PI) B.insuaris Spot 412 Anticoagulant protein A [Deinagkistrodon acutus] Spot 356 Metalloproteinase (Agkistrodon contortrix laticinctus) Spot 386 and 394 Phospholipase A2 B. insularis 433 e 434 Agkisacutacin B chain [Deinagkistrodon acutus] 489 BJcuL precursor [B. jararacussu]. Spot 24, 28, 29, 30, 31, 32, 77, 90, 93 and 96 Metalloproteinase (PIII) B.insularis Spot 444 Unnamed Protein Product (Mus Musculus)

23 Análise de Peptídeos: Peptidomics
A eletrofores bidimensional separa proteínas entre 10 kDa e 200 kDa: Proteínas maiores ou menores não são detectadas; Para análise de peptídeos dependendo da amostra podemos analisar diretamente no MALDI-TOF, ou ainda fazer uma separação prévia e analisar frações cromatográficas contendo peptídeos.

24 B. insularis crude venom
MALDI-TOF/MS

25 Crude venom direct analysis in MALDI-TOF
Lachesis muta MS/MS 1373 P I / L H P G qkpwppghipp Peptídeo potenciador de bradicinina

26 PROJECTS : 1. Proteomics of animal toxins : Jonas Perales (FIOCRUZ), Gilberto Domont, (DQ-IQ/UFRJ), Russolina Benedeta Zingali (DBM/ICB/UFRJ), Elias W. Alves (UENF) 2. Proteoma de Expressão de Vibrio cholerae : Wanda Maria Almeida von Krüger, Ana Beatriz Furlanetto Pacheco (UMGe/IBCCF/UFRJ), Ana Coelho (DG/IB/UFRJ) 3. Proteomics of viral infection ( dengue virus): Mônica Montero Lomeli, Andréa Thompson Da Poian, Russolina Benedeta Zingali, (DBM/ICB/UFRJ) 4. Proteome analysis of Gluconacetobacter diazotrophicus : Elias W. Alves (UENF), José Ivo Baldani, Kátia Regina dos Santos Teixeira, (EMBRAPA/RJ), Paulo Ferreira, Adriana Hemerly (DBM/UFRJ)

27 A proteome reference map for Vibrio cholerae El Tor
Ana Coelho, Eidy de Oliveira Santos, Mauro Luiz da Hora Faria, Daniela Palermo de Carvalho, Marcia Regina Soares, Wanda Maria Almeida von Kruger, Paulo Mascarello Bisch Proteomics Network of Rio de Janeiro-FAPERJ Dep. Genética, I. Biologia Biofísica Carlos Chagas Filho, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, Brazil Abstract A proteome reference map has been constructed for Vibrio cholerae El Tor, in the pI range of 4.0 to 7.0. The map is based on two-dimensional gels (2-D) and the identification, by peptide mass fingerprint, of proteins in 94 spots, corresponding to 80 abundant proteins. Two strains are compared, strain N16961 and a Latin American El Tor strain C3294. The consensus map contains 340 spots consistently seen with both strains grown in Luria-Bertani broth (LB) or minimal M9 medium. The results were obtained from nine gels run with 18 cm immobilized pH gradient strips and precast gels. The 2-D gels were anchored to real N16961 proteins identified by mass spectrometry. Various energy metabolism components and periplasmic ATP-binding cassette (ABC) transporter proteins were identified among the abundant proteins. Two isoforms of OmpU were found. Five operons are proposed and seven hypothetical proteins were experimentally confirmed. Comparisons are made with protein 2-D gels for a classical strain and to microarray analysis available for the N16961 El Tor strain. New results were obtained from the proteome analysis, indicating an abundance of periplasmic ABC transporter proteins not found in microarray studies. Proteomics May;4(5):

28 Adherence of Vibrio cholerae El Tor to cell monolayers.

29 2D-gel, V. cholerae El Tor N16961 strain

30 Experimental and predicted proteins for V. cholerae El Tor
Total number of proteins predicted:………3820 In the pI range 4-7 and MW kDa:…2005 Spots found: ………………………………….539 Coverage in the range: ……………………26.9%

31 Mapa de referência de Vibrio cholerae El Tor com 94 spots

32 Isoformas: a mesma proteina em spots diferentes

33 Identification of spots by peptide mass fingerprint:
94 spots, corresponding to 80 proteins Main cellular roles found: spots proteins Energy metabolism 36 28 (TCA cycle) (9) (8) (glycolysis/gluconeogenesis) (11) (7) Transport and binding proteins 16 13 (Solute-binding protein of ABC transporters) (15) (12) (other transporters) (1)

34 Hypothetical and conserved hypothetical proteins identified as abundant proteins

35 Estudo de gens hipotéticos e hipotéticos conservados:
Uma vez identificados a partir de gel, deixam de ser hipotéticos São proteínas abundantes na célula, provavelmente importantes

36 (ou outros que desejar)
Metodologia básica para estudo de gens hipotéticos (ou outros que desejar) Inativação do gen por mutação dirigida, e estudo do fenótipo; Verificação da presença de anticorpos em soro de ex-pacientes de cólera; Superexpressão da proteína, estudo de estrutura.

37 PROJECTS : 1. Proteomics of animal toxins : Jonas Perales (FIOCRUZ), Gilberto Domont, (DQ-IQ/UFRJ), Russolina Benedeta Zingali (DBM/ICB/UFRJ), Elias W. Alves (UENF) 2. Expression Proteomics of Vibrio cholerae : Wanda Maria Almeida von Krüger, Ana Beatriz Furlanetto Pacheco (UMGe/IBCCF/UFRJ), Ana Coelho (DG/IB/UFRJ) 3. Proteoma da infecção viral (virus da dengue): Mônica Montero Lomeli, Andréa Thompson Da Poian, Russolina Benedeta Zingali, (DBM/ICB/UFRJ) 4. Proteome analysis of Gluconacetobacter diazotrophicus : Elias W. Alves (UENF), José Ivo Baldani, Kátia Regina dos Santos Teixeira, (EMBRAPA/RJ), Paulo Ferreira, Adriana Hemerly (DBM/UFRJ)

38 Dengue virus membrana: proteína E proteína M capsídeo: proteína C
Crio-microscopy Replication cycle membrana: proteína E proteína M capsídeo: proteína C RNA fita simples positiva

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40 Clinical manifestations
Assymptomatic  hemorragic fever / shock sindrome (DHF/DSS) DHF in Americas

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42 Effect of DEN infection in liver cells
HepG2 cells - human hepatoma cell line Lima, C.S. ; Leão, S.C.L. and Da Poian, A.T. Dept. Bioquímica Médica, ICB, UFRJ

43 OBJETIVOS Identificação da modificação do padrão de expressão de proteínas durante a infecção pelo virus da dengue; (Depto Bioq. Med. Instituto Biof.) 2. Identificar as proteínas/ peptídeos secretados pelas células HepG2 em cultura durante a infecção viral. (Depto Bioq.Med.) 3. Analisar os soros de pacientes com Dengue grave comparado ao soro de pacientes normais. (Fiocruz) 4. Identificar marcadores para diagnostico além de novos alvos terapeuticos para o desenvolvimento de drogas antivirais.

44 Célula escolhida Hep G2 (hepática) Com 2 dias de infecção.
1a. Parte estabelecimento de protocolo de replicação do virus da Dengue 2 em diferentes tipos celulares Célula escolhida Hep G2 (hepática) Com 2 dias de infecção.

45 Estabelecimento do protocolo para análise do extrato celular
2D-electrophoresis cellular extracts (intracellular RNAs and proteins) control and infected cells 2 days mass spectrometry

46 Proteome of HepG2 cells infected by DEN2
control cells infected cells (2 days) 116 66  45  29 20   4.0 7.0 4.0 7.0

47 Estabelecimento do protocolo para análise das proteínas secretadas
2D-electrophoresis (proteins) concentration (secreted proteins) mass spectrometry control and infected cells 2 days culture medium (secreted proteins) 6 hr or 20 hrs

48 Proteoma do secretado protéico das células (20 hrs) analisado por eletroforese 2D
HepG2 infected cells secreted proteins HepG2 control cells secreted proteins

49 Análise de Peptídeos e identificação
PEPTIDOMICS

50 concentration control and infected cells 2 days culture medium
2D-electrophoresis (proteins) concentration (secreted proteins) mass spectrometry control and infected cells 2 days culture medium (secreted proteins) 20 hrs ultrafiltration (peptides) RP HPLC Concentration by lyophilization

51 Separação do ultrafiltrado por cromatografia de fase reversa
B Conc. Minutes 30 40 50 60 70 80 90 100 mAU -500 500 1000 1500 2000 2500 3000 mL/min 20 Reversed phase chromatography of ultra-filtrate HepG2 cells. Blue Blanc (DMEM medium in the presence of fungicide and protease inhibitors), Green Ultrafiltrated from controle cells (HepG2) e red ultrafiltrated from 2 days infected cells (HepG2).

52 PROJECTS : 1. Proteomics of animal toxins : Jonas Perales (FIOCRUZ), Gilberto Domont, (DQ-IQ/UFRJ), Russolina Benedeta Zingali (DBM/ICB/UFRJ), Elias W. Alves (UENF) 2. Expression Proteomics of Vibrio cholerae : Wanda Maria Almeida von Krüger, Ana Beatriz Furlanetto Pacheco (UMGe/IBCCF/UFRJ), Ana Coelho (DG/IB/UFRJ) 3. Proteomics of viral infection ( dengue virus): Mônica Montero Lomeli, Andréa Thompson Da Poian, Russolina Benedeta Zingali, (DBM/ICB/UFRJ) 4. Proteome analysis of Gluconacetobacter diazotrophicus : Elias W. Alves (UENF), José Ivo Baldani, Kátia Regina dos Santos Teixeira, (EMBRAPA/RJ), Paulo Ferreira, Adriana Hemerly (DBM/UFRJ)

53 Initial phase of a proteome project to fuel the understanding
of Gluconacetobacter diazotrophicus physiology Lery LMS; Viana, FC; Soares, MR; Teixeira KRS; von Kr¨uger WMA; Bisch, PM Rede de Proteomica do Estado do Rio de Janeiro Gluconacetobacter diazotrophicus is a N2-fixing, aerobic, Gram-negative bacterium found as an endophyte in roots, stems and leaves of sugar cane, as well as in Pennisetum purpureum, Ipomoea batatas and Coffea arabica. Bacteria were present in the intercellular apoplast of sugar cane stems and they have also been detected in the xylem vessels at the base of the stem. Moreover, was reported the occurrence of intracellular bacteria in sugar cane root tips.

54 LGI medium (N2 non-fixing condition)

55 A - Logaritmic phase 250kD 10kD 3 10

56 10kDa 250kDa 3 10 B) Stationary phase

57 Analysis of soluble cellular proteins expressed by
Gluconacetobacter diazotrophicus Number of protein spots detected in Coomassie Blue stained gels: 330 from logaritimic phase cells, 356 from stationary phase cells, Revealing 376 different spots. 203 spots were common to both conditions, 54 present only in stationary phase and 19 only visible in logaritimic phase. Other detected spots presented quantitative or qualitative variations.

58 Postranslationally modificated.
5.3 5.6 ~47kD Two 2DE protein bands expressed by both logaritmic and stationary phases and respective MALDI-TOF spectrums, showing that they correspond to the same protein (ModC), Postranslationally modificated.

59 ~16kD 6.1 6.4 Spots only visible in logaritmic or stationary cells
(arrows), indicating different protein expression along growth curve. Some common spots varied in intensity with growth phase. ~16kD 6.1 6.4

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65 Obrigada pela atenção Outras abordagens possíveis:
Proteoma de secreções: plasma, urina, liquor, etc com objetivos de diagnóstico; Proteoma de secreções: semem, plasma, leite, etc com objetivo de controle de qualidade; Proteoma de organelas celulares, ou do secretado celular; Fosforoma; interactoma, peptidoma, ...omas... Obrigada pela atenção