SENSORES EM LINHA PARA PROPRIEDADES CELULARES

Apresentação em tema: "SENSORES EM LINHA PARA PROPRIEDADES CELULARES"— Transcrição da apresentação:

1 SENSORES EM LINHA PARA PROPRIEDADES CELULARES
Determinação da concentração de biomassa São medidas indiretas Necessitam de uma curva de calibração (correlação entre a variação da propriedade medida e a concentração celular) Um dos maiores problemas é a falta de linearidade de tal curva em altas concentrações de biomassa Não existe um método de aplicação geral, por causa das restrições devido às características do crescimento e do meio de cultivo - A maioria dos métodos mede a biomassa total

2 A. Turbidimetria A turbidez de um meio depende do número de partículas que ele contém, do tamanho e da forma destas partículas Os métodos levam em conta que a turbidez do meio é proporcional à sua concentração de biomassa O feixe de luz incidente na suspensão celular está sujeito a pelo menos cinco fenômenos: Absorção da luz pela biomassa Transmissão da luz Espalhamento da luz na mesma direção de incidência do feixe Espalhamento perpendicular à direção de incidência do feixe Espalhamento na direção contrária ao de incidência do feixe Embora existam aparelhos para medir estes fenômenos, a maioria mede, em meios biológicos, a luz transmitida

3 Fenômenos envolvidos na determinação da biomassa celular.

4 Fenômenos envolvidos na determinação da biomassa celular.
Espalhamento 90o Espalhamento frontal Luz incidente Amostra turva Espalhamento 180o Luz transmitida Fenômenos envolvidos na determinação da biomassa celular.

5 Medidor de turbidez Biorreator Meio Câmara de desgaseificação Análise e registro de dados Esquema de uma sistema de medida de biomassa em linha por turbidimetria.

6 Uma das formas de se determinar concentrações de biomassa em faixas maiores é variar a espessura do caminho de percurso do feixe de luz. Tubo interno Densidade ótica Entrada da amostra Saída da amostra Densidade celular Diagrama esquemático de uma célula de fluxo para medida de luz transmitida (a) e variação da densidade ótica com a concentração de biomassa para diferentes valores de d (b).

7 (b) (a) Esquema de turbidímetro para medida da luz transmitida e da luz espalhada no sentido de incidência do feixe (a) e para medida da luz espalhada no sentido oposto ao de incidência do feixe (b).

8 a b Esquema de determinação de biomassa por medida da luz espalhada no sentido oposto ao de incidência do feixe: (a) detalho do instrumento de medida e (b) esquema geral.

9 B. Fluorescência Princípio do método: fluorescência do NADH e NADPH de células vivas quando irradiados com luz ultravioleta Comprimento de onda de incidência: nm Comprimento de onda de fluorescência: cerca de 460 nm A intensidade de fluorescência é afetada pela quantidade de biomassa, pelo estado metabólico das células e também por fatores abióticos como bolhas e componentes fluorescentes do meio Não há circulação de amostra pelo equipamento, o que indica uma montagem mais simples em relação a outros O método tem potencial para uso em sistemas com células imobilizadas

10 Desenho esquemático de um sensor de fluorescência.

11 Fluorescência de uma cultura de Zymomonas mobilis em função da concentração de biomassa, em diferentes concentrações de glicose.

12 C. Calorimetria A produção de calor é um parâmetro relacionado com atividade metabólica, concentração de biomassa e consumo de substrato O maior problema é “separar” o calor produzido pelas células do calor produzido ou consumido por outros processos (aeração, agitação, adição de ácido/base, ou nutrientes) O estado metabólico das células influencia na quantidade de calor gerado, alterando os termogramas. Neste caso, a relação entre calor produzido e quantidade de biomassa fica comprometida

13 D. Filtração A concentração de biomassa pode ser estimada a partir do volume da torta filtrada, do fluxo de filtração, do volume de filtrado e da diferença de pressão através do sistema de filtração Corresponde a um sistema de medida semicontínuo Foi demonstrado que a concentração de biomassa pode ser obtida pela equação: X = (1/ν). VC/(Vf+VC) Onde: X é a concentração de biomassa (g/L) v é o volume específico da torta (L/g) VC é o volume da torta (L) Vf é o volume do filtrado (L)

14 Diagrama esquemático de um sistema de filtração para medida de biomassa.

15 Comparação de dados de biomassa obtidos por filtração em linha com os obtidos por métodos off-line, para o cultivo de Penicillium chrysogenum.

16 E. Outros métodos Métodos por viscosidade Métodos Eletroquímicos - Métodos Impedométricos - Sensores potenciométricos - Sensores tipo células de combustível - Sensores amperométricos Métodos acústicos

17 Determinação de biomassa ativa
A viabilidade celular pode ser medida em separado por três principais métodos: Coloração vital Replicação celular Atividade metabólica - Tais métodos demandam tempo considerável

18 Citometria de fluxo Técnica que permite analisar várias características celulares ao mesmo tempo O aparelho, citômetro de fluxo, capta e digitaliza a dispersão de luz provocada pela passagem de partículas em suspensão alinhadas uma a uma, num fluxo laminar, frente a um feixe de luz Componentes básicos do citômetro de fluxo: Fluido – suspensão de partículas e fluxo laminar Óptico - Fonte de iluminação, Captação da dispersão da luz e da fluorescência e Filtração da dispersão e da fluorescência Eletrônico - Conversão do sinal em valores analógico-digitais Aquisição, Processamento, Análise e Armazenamento por computador

19 Exemplo do que pode ser analisado por citometria de fluxo.
Metabolismos Receptores ADN Citoquinas Enzimas Antigénios celulares Tamanho Complexidade Exemplo do que pode ser analisado por citometria de fluxo.

20 SISTEMA FLUIDO FILTRO DE AR GERA PRESSÃO AO FLÚIDO ENVOLVENTE “SHEATH”
Baixa pressão da amostra 12µl/min Amostra Fluxo Laminar BAIXA PRESSÃO DIFFERENCIAL Bainha ALTA PRESSÃO DIFFERENCIAL Alta pressão da amostra 60µl/min

21 SISTEMA ÓTICO FACSCalibur . FL1 Red Diode Laser ~635 nm SSC FL3 FL4
670LP 661/16 585/42 488/10 90/10 Beam Splitter DM 560SP Fluorescence Collection Lens DM 640LP Half Mirror . 488 nm Blue Laser FSC Diode Focusing Lens FL2 530/30 Beam Combiner Flow Cell

22 Diagrama esquemático representando os sistemas ótico e fluido de um citômetro de fluxo.

23 Ótica de espalhamento frontal
Sensor de FS Laser

24 Ótica de espalhamento lateral
Laser Sensor de FS Sensor SS 900

25 Ótica de fluorescência
Laser Sensor de FS Detectores de Fluorescência (PMT1, PMT4 etc.)

26 LASER ÂNGULO DE DISPERSÃO LATERAL (SSC)
QUANDO A CÉLULA CRUZA O LASER OCORRE DISPERSÃO DA LUZ PARA TODOS OS LADOS, MAS SÓ EM DUAS DIREÇÕES ELA É ANALISADA: A REFRAÇÃO DA LUZ NO ÂNGULO DE 950 É DENOMINADA ÂNGULO DE DISPERSÃO LATERAL E REVELA A COMPLEXIDADE DO CONTEÚDO CITOPLASMATICO. A REFLEXÃO DA LUZ NA FAIXA DE 1 A 50 FORMA O ÂNGULO DE DISPERSÃO FRONTAL E REVELA O VOLUME DA CÉLULA. ÂNGULO DE DISPERSÃO FRONTAL (FSC)

27 Foto de um citômetro de fluxo.

28 Foto do sistema ótico de um citômetro de fluxo.

29 Tipos de diagramas (Resposta)
1 parâmetro Histograma 2 parâmetros Gráfico de pontos Gráfico de Contorno Gráfico de Densidade

30 Foto de um citômetro de fluxo.

31 Análise por Injeção em Fluxo (Flow Injection Analysis)
Fundamento: Injeção de uma amostra numa corrente líquida contínua não segmentada. À corrente de amostra são adicionados reagentes, de modo a formar uma zona de reação que é continuamente transportada para um detector, o qual pode determinar absorbância, potencial elétrico ou qualquer outra propriedade física da solução A análise (FIA) compreende três blocos principais: Manipulação da amostra e transporte, que consiste em retirar uma amostra do reator e condicioná-la para a análise Especificação, que consiste na eliminação de interferentes e outros produtos, de maneira a assegurar a proporcionalidade da propriedade medida com o analito

32 - Detecção, que consiste no emprego de um transdutor, de forma a gerar um sinal proporcional à espécie a ser determinada Existe uma grande flexibilidade para se compor esses três blocos, de modo a se montar distintos sistemas de análise. Principais vantagens do sistema FIA: Alta frequência de análises Pequenos volumes da amostra Amostragem e preparação da amostra integrados ao sistema Calibração a qualquer momento Poucas interferências Confiabilidade Longos períodos de operação dos sensores Flexibilidade para incorporação de novas técnicas analíticas

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36 Determinação de biomassa em bioprocessos
Essencial para o conhecimento e controle de bioprocessos Variável utilizada para a determinação das velocidades específicas de crescimento, de consumo de substrato e de formação de produtos Modelagem matemática do crescimento, do consumo de substrato e da formação de produto Comportamento cinético do processo