Aluna: Glauce Moreno Barbosa Disciplina:Termogênese nos Seres Vivos Novembro, 2012.

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1 Aluna: Glauce Moreno Barbosa Disciplina:Termogênese nos Seres Vivos Novembro, 2012.

2  Beija-flor: ◦ Família: Trochilidae ◦ Gênero: Phaethornis ◦ Espécie: Phaethornis ruber  Presente de São Paulo ao norte do Brasil.  Não possui tecido adiposo marrom não apresenta UCP1.  É capaz de atravessar longo período de heterotermia (altas taxas metabólicas).

3  Termogênese adaptativa ◦ Produção de calor em resposta ao ambiente ou dieta. ‣Em aves: o Principal tecido termogênico – músculo esquelético o Resposta metabólica induzida pelo frio - 3 a 8 vezes taxa metabólica padrão o Reposta metabólica provocada pelo vôo - 5 a 10 vezes taxa metabólica padrão

4  Mecanismos Termogênicos em Pássaros ◦ Em beija-flor: músculo peitoral é o principal candidato para geração de calor. ◦ Durante aclimatização ao frio: Ca +2 ATPase e receptor rianodine no retículo sarcoplasmático.

5  Estudos prévios com beija-flor ◦ Razão entre hidrólise de ATP e síntese de ATP, com liberação de Ca +2 do retículo sarcoplasmático do músculo peitoral – 2 vezes maior do que no retículo sarcoplasmático de músculo esquelético de coelho. ◦ Na presença de Ca +2, 2 vezes mais energia é convertida em calor no beija-flor.

6  Termogênese por não tremor em pássaros ◦ Sua importância ainda é discutida, pois a principal termogênese dos pássaros em resposta ao frio é por tremor. ◦ Estudos prévios demonstraram a presença de termogênese por não tremor em patos.  Determinação da taxa metabólica Teulier, L. et al. The Journal of Experimental Biology, 2010.

7  LCT menor em patos aclimatados a 4ºC.  Capacidade para termogênese por não tremor é maior em patos aclimatados ao frio. Teulier, L. et al. The Journal of Experimental Biology, 2010.

8 o Taxa de consumo de oxigênio durante estímulo máximo por ADP (estado 3), repouso (estado 4) e desacoplamento induzido por FCCP (estado 3 unc) foi maior nos patos aclimatizados a 4ºC. o O consumo máximo de oxigênio (citocromo c oxidase) não foi alterado pela aclimatização ao frio. Teulier, L. et al. The Journal of Experimental Biology, 2010.

9  Homólogo da proteína desacopladora em beija-flor da espécie Eupetomena macroura ◦ HmUCP – 304 aminoácidos, 32,8kDa. Homologia com UCP3 de humanos (72%). ◦ HmUCP - uptake de 3’.3-dihexil-oxacarbocianida iodide (DiOC 6 ) - reduz potencial de membrana. Vianna, C. et al. The American Physiological Society, 2001.

10 ◦ HmUCP é encontrada principalmente no músculo peitoral. Em menor quantidade: coração, fígado, pulmão e rins. Não detectada no cérebro. ◦ Níveis de mRNA HmUCP diferentes de acordo com a condição fisiológica (eutermia, torpor e reaquecimento). Vianna, C. et al. The American Physiological Society, 2001.

11 ◦ taxa de consumo de O 2 no torpor, retornando a níveis semelhantes a eutermia durante o reaquecimento. Vianna, C. et al. The American Physiological Society, 2001.

12  Avaliar o processo de termogênese por não tremor no beija-flor da espécie Phaethornis ruber.

13  Determinar a alteração na taxa metabólica do beija-flor aclimatizado em duas temperaturas distintas.  Avaliar a presença de UCP (homóloga a UCP humana) e o papel da mitocôndria no músculo esquelético, após exposição do beija-flor a diferentes condições de temperatura.

14  Aclimatação do beija-flor Phaethornis ruber a diferentes temperaturas.  10 dias – fotoperíodos constantes luz – 8h escuridão - 16h Condição 1 Eutermia (35ºC – 40ºC) Condição 2 Torpor (10ºC – 15ºC)

15  Determinação da taxa metabólica do beija-flor ◦ Calorimetria indireta – sistema de circuito aberto  Beija-flor em jejum overnight  Condições do experimento: Fluxo de ar atmosférico constante. Temperaturas (10 e 40ºC) controladas.  Variáveis a serem determinadas: Temperatura e pressão padrões Razão entre consumo de O2 e produção de CO2

16  A relação entre taxa metabólica e temperatura ambiente deverá ser expressa como regressão linear determinar a temperatura crítica mais baixa (LCT).  Espera-se que a LCT seja menor no beija-flor submetido a temperatura (10-15ºC) do que ao aclimatizado a temperaturas maiores. Taxa metabólica maior quando aclimatizados a menores temperaturas durante longo período de tempo.

17  Análise da termogênese por não tremor ◦ Medida simultânea da taxa metabólica e da eletromiografia do músculo peitoral (termogênese por tremor). Atividade por não tremor = taxa metabólica (determinada a temperatura limiar de tremor) – taxa metabólica no repouso

18  Espera-se que os pássaros aclimatados ao frio apresentem uma menor atividade muscular ( atividade eletromiográfica).  Nos pássaros aclimatados ao frio, espera-se que sua capacidade para termogênese por tremor seja maior.

19  Coleta do tecido muscular esquelético para isolamento mitocondrial Isolamento mitocondrial

20  Dosar proteína total mitocondrial  Verificar expressão gênica de UCP por RT-PCR e expressão proteica por Western Blotting.

21  Maior quantidade de proteína total mitocondrial no músculo esquelético de beija-flor aclimatizado ao frio.  Padronizando-se a quantidade de proteína usada por ensaio, espera-se encontrar maior quantidade de UCP no músculo esquelético deste beija-flor.

22 Tampão de respiração Adição dos substratos succinato e rotenona Adição de ADP – estado de respiração ativa (estado 3) Adição de oligomicina - taxa de respiração não fosforilada basal (estado 4) Adição de FCCP – estado de respiração desacoplada (estado 3 desacoplado) Mixotazol foi adicionado para inibir a respiração por succinato. Adição de ascorbato - determinar a taxa de respiração máxima associada à atividade da citocromo c oxidase.

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24  Aumento da taxa de consumo de oxigênio durante estímulo por ADP (estado 3), repouso (estado 4) e desacoplamento induzido por FCCP (estado 3 desacoplado ) em beija-flor aclimatizado ao frio.  Aumento da função mitocondrial associada ao desacoplamento em músculo esquelético após aclimatação ao frio.

25  Associar a superexpressão de UCPs no tecido muscular esquelético de beija-flor aclimatizado ao frio com ativação de receptores  -adrenérgicos.  Correlacionar a superexpressão de UCPs com a redução da termogênese por tremor – estudo da ciclagem de Ca+2.

26  Os resultados esperados sugerem que, para a adaptação do beija-flor da espécie Phaetornis ruber a temperaturas reduzidas, é necessário o controle da expressão da proteínas desacopladora (homóloga a UCP) para a termogênese por não tremor.