UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA

Apresentação em tema: "UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA"— Transcrição da apresentação:

1 UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FARMÁCIA ALUNA: SUELLEN GAVRONSKI FLORIANÓPOLIS, 25/08/2015

2 Introdução O termo epigenética refere-se a todas as mudanças reversíveis e herdáveis no genoma funcional que não alteram a sequência de nucleotídeos do DNA Existem três mecanismos principais de alterações epigenéticas: metilação do DNA, modificação de histonas e ação de RNAs não codificadores Falando um pouquinho a respeito dos termos do artigo, eu vou começar pela epigenética que seriam modificações no material genômico não relacionadas a alteração na sequência de nucleotídeos, mas que mesmo assim ditam a forma como nossos genes vão ser ou não expressos, como eles vão ser expressos e quando. Existem três mecanismos... Falar um pouco... Nesse artigo, é falado um pouco a respeito da metilação do DNA, mas principalmente é dada uma atenção especial às alterações das histonas, sobretudo à metilação de uma parte da histona, que eu vou falar um pouco mais adiante. Outro fator determinante na expressão gênica, considerado o fator primário nesse quesito que é abordado no artigo seria a ligação de fatores de transcrição, que seriam proteínas que se ligam a sequencias específicas de DNA (promotores ou enhancers) para justamente controlar o índice de transcrição daquele gene, aumentando ou diminuindo a taxa de transcrição do gene. A ubiquitina é uma proteína encontrada nas células eucariotas constituída por 76 aminoácidos que desempenha uma função importante na regulação de proteínas. Ela marca proteínas indesejadas (por exemplo proteínas mal-dobradas) para que sejam degradadas por organelas chamadas proteassomas.

3 Introdução Dentre as técnicas que elucidam a ligação de fatores de transcrição ao DNA, destacam-se a PBM (protein binding microarray) (in vitro) e a Chip ou Chip-Seq (Chromatin immunoprecipitation seguida de sequenciamento) (in vivo). Desvantagens: utilização de FT purificados e de difícil manuseio, não permitindo a análise complexa e multi-paramétrica das modificações epigenéticas. A tecnologia MagPIE (magnetic protein immobilization on enhancer DNA) foi desenvolvida com o objetivo de permitir a análise multi-paramétrica e rápida das interações entre fatores de transcrição (FT), cromatina e DNA, bem como suas modificações epigenéticas resultantes. Na PBM, os fatores de transcrição purificados são incubados com um arranjo de oligonucleotídeos e marcados usando a imunofluorescência, levando a informações das sequencias de nucleotídeos aos quais os FTs se ligavam. No Chip-Seq, FTs se ligam ao DNA de células vivas, o DNA é então fragmentado, o FT ligado a uma sequencia é precipitado e o DNA é eluído e analisado por PCR. Esse DNA é posteriormente sequenciado.

4 Introdução

5 Metodologia Amplificação do DNA e ligação às beads
Todas as sequências foram amplificadas e ligadas as beads com primers com mínima afinidade por fatores de transcrição. Processo: Beads magnéticas com streptavidina são precipitadas com um ímã Beads são resuspendidas no tampão de ligação Adição de DNA biotinilado Incubação por 20 a 60’ Lavagem e bloqueio com 4% de leite Armazenamento

6 Metodologia Cultura de células
Foram utilizadas células embrionárias murinas mantidas em meio DMEM suplementadas com 15% de soro fetal bovino. Quando necessário, as células foram tratadas com doxiciclina para estimular a proliferação e induzir a expressão de fatores de transcrição. cells (18) were maintained on gelatin-coated plates with mouse embryonic fibroblast feeders in Knockout DMEM (Invitrogen) supplemented with 15% ES tested fetal bovine serum (FBS) (HyClone), 0.1 mM nonessential amino acids (Invitrogen), Glutamax (Invitrogen), 0.55 mM 2-mercaptoethanol (Sigma) and 1ESGRO LIF (Chemicon).

7 Metodologia Preparação do lisado nuclear
Lavagem dupla das células com PBS gelado Células foram raspadas, colocadas num pellet e centrifugadas Células são resuspendidas em solução de lise e incubadas por 15’ a 4°C Adição de um agente detergente e centrifugação Resuspensão em solução de lise nuclear, incubação e centrifugação Purificação em coluna Preparação de alíquotas, congelamento em nitrogênio líquido e armazenamento a -80°C

8 Metodologia Ligação do DNA as proteínas
Descongelamento e diluição do lisado (~1/3mg/ml) Incubação do lisado com as beads recobertas com o DNA Incubação por 10’ a 37°C Junto com DNA competidor Resuspensão das beads em 10 μl de solução de anticorpos primários e anticorpos secundários ligados a um fluoróforo. Análise adicional por espectrometria de massas Incubação por 20-60’ a 4°C Lavagem, resuspensão e avaliação por citometria de fluxo

9 Resultados Interação DNA-proteína Sequência aleatória de 130pb
Ligação as beads Amplificação de sequências de DNA Sequência de 150pb de uma região contendo um sítio forte de ligação a Cdx2 Incubação com o lisado contendo o FT Cdx2 com o epítopo V5 Análise da interação por citometria de fluxo Marcação com o anticorpo anti-V5 Os FTs interagem com sequências de DNA contendo sítios de ligação específicas

10 Resultados Para confirmar que a ligação do DNA ao FT Cdx2 é dependente do sítio de ligação para Cdx2, foi analisado o efeito de sítios de ligação mutados. Sequências de 40pb com sítios de ligação Cdx2 com um motif fraco e forte Amplificação utilizando os primers MagPIE biotinilados gerando uma seqüência de 88 bp.

11 Resultados Somente a mutação do sítio de ligação forte diminui a ligação ao FT

12 Resultados A ligação a outros fatores de transcrição (Sox2 e Onecut1) com sítio de ligação mutada também foi afetada.

13 Resultados Análise comparativa da afinidade de ligação da sequência de DNA ao fator de transcrição A intensidade da imunofluorescência é relacionada ao grau de afinidade com o sítio de ligação Marcação e análise por citometria de fluxo Seleção de 16 sequências com afinidades variáveis ao sítio Cdx2 Incubação com o lisado contendo o FT

14 Resultados Análise de múltiplos eventos epigenéticos
Coloquei essa imagem por que o artigo dá uma enfase especial no estude de um marcador de histonas chamado H3K4Me1, que significa um grupo metila colocado na lisina 4 da histona H3. Essa marcação é comum quando a cromatina está na forma de heterocromatina, menos compactada, logo está diretamente implicada num mecanismo que facilita a transcrição de determinado gene. Esse é um marcador de enhancer regions As enhancer regions se encontram a uma certa distância dos promotores. Eles são seqüências curtas de DNA (~200 pb), contendo várias sequencias menores (~25 pb) que são sítios de ligação para uma variedade de fatores de transcrição específicos. Proteínas de ativação que podem ser FTs se ligam a por~ções do DNA chamadas enhancer regions e dobram o DNA, trazendo-o perto de uma região promotora. Um complexo proteico é formado, que se liga ao promotor. Então, a maquinaria basal de transcrição é ativada pela ligação à região promotora.

15 Resultados Metilação do DNA
Sequências flanqueadoras de regiões com dinucleotídeos CG foram amplificadas e marcadas com anticorpos contra citosinas metiladas antes e após a incubação. A incubação com o lisado induz a reatividade da metil-citosina e pode ser inibida com a pré-incubação do lisado com o inibidor de DNA metiltransferase RG108.

16 Resultados Ligação das sequências de DNA a histonas após a incubação com o lisado. Em todos os experimentos, histonas H1, H2 e H3 foram detectadas, indicando que ocorre a ligação de histonas durante a realização da técnica analisada. A análise de espectrometria de massas foi realizada nas beads ligadas a sequências de DNA com o sítio de ligação Cdx2 e sequências aleatórias de 88, 150 e 250 pb.

17 Resultados Foi analisado se sequência que possuíam a marcação para H3K4Me1 em células embrionárias apresentavam maior reatividade após incubação com o lisado, o que foi posteriormente confirmado. Para isso, foram testadas 4 sequências com a marcação e 8 sequências sem.

18 Resultados As sequências reativas apresentam uma região de 200pb com sítio de ligação forte para o motif Sox-Oct, dois fatores de transcrição. As sequências não reativas não apresentam este sítio de ligação. Logo, sabe-se que a sequência de H3K4Me1 apresenta sítio de ligação para os FTs Sox-Oct. Duplo positivo Duplo negativo

19 Resultados Para testar a relação entre a ligação dos FT e a presença do marcador H3K4Me1, foram sintetizadas sequências com mutações pontuais nos sítios de ligação Oct e Sox2. Mutações no sítio Oct4 reduziram a reatividade para H3K4Me1 em maior grau quando comparada com a mutação do sítio Sox2 Além disso, a mutação no sítio Oct diminuiu a reatividade do FT Sox2, indicando um relação de cofatores Isso indica que a metilação de histonas é dependente da ligação com FTs (principalmente Oct4) Aqui foram testadas sequências do marcador H3K4Me1 com sítios de ligação mutados para Oct e Sox e foi visto que... Logo, é possível verificar a ligação de FTs, sendo a metilação de histonas (H3K4Me1) relacionada com a ligação dos FTs Sox-Oct.

20 Sequência após ligação as beads e digestão com DNase
Resultados Para saber se as histonas são ligadas na forma de nucleossomos, foi feita a digestão com Dnase I, uma vez que a presença de nucleossomos impede a ação desta enzima. Uma região H3K4Me1 de 250 bp foi sintetizada e ligada as beads e sujeitada a digestão com DNAse I antes e após a incubação com o lisado. A incubação com o lisado impediu a digestão por DNAse I o que sugere a presença de nucleossomos. Sequência após a ligação as beads e incubação com o lisado (não digerido) DNA ladder Sequência de 250 pb com o sítio de ligação Sox-Oct antes de ser ligado as beads Sequência após ligação as beads e digestão com DNase

21 Resultados Para saber se ocorria a metilação das histonas durante o MagPIE, foi realizado o ensaio na presença de um análogo não hidrolisável do ATP (ATP gama S), o que diminuiu a atividade da H3K4Me1, sugerindo que ocorre a metilação das histonas durante a incubação com o lisado.

22 Discussão É possível monitorar as interações entre DNA e fatores de transcrição pela técnica. Consiste em uma técnica rápida (resultados são obtidos após 2h), com pequenas quantidades de proteína e cujos complexos DNA-FT são estáveis por várias horas. Todos esses processos detectados estão relacionados a incubação com o lisado nuclear bruto, uma vez que o mesmo possui as enzimas catalizadoras

23 Discussão A técnica de MagPIE permite analisar: metilação de histonas;
metilação do DNA; ligação de fatores de transcrição; ligação de histonas; ligação de nucleosomos; atuação de cofatores. A ligação de FTs são dependentes de sequências específicas.

24 Conclusão Como alguns citômetros podem ler >10 λ, a análise de simultâneas interações pode ser visualizada por esta técnica. Espera-se que com o desenvolvimento de mais anticorpos para FTs e modificações de histonas, tais eventos possam ser investigados de forma mais aprofundada. De forma geral, esta continua sendo uma metodologia promissora para a análise multi-paramétrica de interações e modificações do material genético analisado.

25 Obrigada!