Avaliação da produção de giberelina pelo fungo Moniliophthora perniciosa durante a interação com cacaueiro Alinne Batista Ambrósio Orientador: Prof. Dr.

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1 Avaliação da produção de giberelina pelo fungo Moniliophthora perniciosa durante a interação com cacaueiro Alinne Batista Ambrósio Orientador: Prof. Dr. Gonçalo Amarante Guimarães Pereira Co-orientadora: Dra. Odalys García

2 SUMÁRIO - Doença vassoura-de-bruxa - Hormônios vegetais
Introdução - Doença vassoura-de-bruxa - Hormônios vegetais - Por que a giberelina? Objetivos Metodologia Resultados preliminares Riscos

3 INTRODUÇÃO Vassoura-de-bruxa AIME AND PHILLIPS-MORA, 2005.

4 - Frutos partenocárpicos
Introdução Sintomas - Hipertrofia - Hiperplasia - Superbrotamento - Frutos partenocárpicos

5 Introdução Hormônios vegetais auxina giberelina citocininas
. etileno citocininas ácido abscísico

6 Introdução Desbalanço hormonal Hospedeiro Patógeno DH Doença

7 - O patógeno pode alterar diretamente o metabolismo dos fitohormônios
Introdução Desbalanço hormonal - O patógeno pode alterar diretamente o metabolismo dos fitohormônios produzidos pela planta

8 Introdução Desbalanço hormonal - Patógenos de plantas são capazes de eles mesmos produzirem fitohormônios

9 Introdução Desbalanço hormonal

10 Introdução Na vassoura-de-bruxa Produção Alteração

11 Divisão de células meristemáticas
Introdução POR QUE GIBERELINA? Giberelina ativa a divisão celular GAs CDKs G1 >>> S G2 >>> M Divisão de células meristemáticas

12 Introdução POR QUE GIBERELINA?
A giberelina induz a elongação de tecidos intactos da planta mediados por proteínas, como expansinas e xiloglucano endotransglicosilase (XET) GAs Expansinas e XET Afrouxamento da parede celular Aumento do tamanho da célula Na apresentação falar sobre os teste e colocar o slide da paredde

13 Introdução POR QUE GIBERELINA? XET Expansinas

14 Introdução POR QUE GIBERELINA?
A giberelina induz a expressão de invertases e amilases Planta sadia Me = medula Mu = canal de mucilagem Me Mu Planta infectada Esquema das amilases e comentar q numa planta sadia isso seria p ativação de um dreno (fruto) disponibilizando açucares soluveis

15 Sintomas Introdução Depois açucares falar tb de Outra
observação interessante é que em muitas plantas a giberelina leva a uma inibição do florescimento, fenômeno efetivamente verificado em plantas infectadas, e talvez a maior causa da quebra da produção. É curioso notar que tem sido conseguida a indução do florescimento do cacau a partir do uso de inibidores de giberelina, como o paclobutrazol (M.W.Müller), reforçando essa possibilidade.

16 Tratamento de sementes de arroz com extrato de esporos de M
Tratamento de sementes de arroz com extrato de esporos de M. perniciosa em comparação com tratamento com giberelina.

17 Introdução Tratamento de plântulas de cacau com extrato de esporos de M. perniciosa

18 Introdução Giberelina Gibberella fujikuroi
GAs são diterpenóides Gibberella fujikuroi Hormônio vegetal que está envolvido na regulação do crescimento e desenvolvimento da planta, incluindo germinação de sementes, crescimento do caule, indução de floração e maturação de frutos 136 GAs vêm sendo identificadas em plantas, fungos e bactérias Conta historia da descoberta no fungo e na planta (fungo ascomiceto patógeno que produz planta boba em arroz) Em 19...

19 Introdução Giberelinas ativas

20 Introdução ggs2 CPS / KS P450-4 P450-1 P450-1 P450-1 P450-1 e 2
ent-Kaurene Geranylgeranyl diphosphate ggs2 CPS / KS P450-4 ent-7alpha-Hydroxy- kauroic acid ent-Kaurenoic acid Gibberellin A12 aldehyde P450-1 P450-1 P450-1 Gibberellin A7 Gibberellin A4 Gibberellin A14 aldehyde P450-1 e 2 GA4 desaturase

21 Clusterização/singlets banco M. perniciosa
Introdução Gene Clusterização/singlets banco M. perniciosa BLAST NR bp total E value GA4 desaturase CP02-S B10-E.F Gibberella fujikuroi des gene for GA4 desaturase --- 0.0 P450-4 CP02-S G04-M.F CP02-S G02-S.F CP02-PF E07-C.G cytochrome P450-4 (ent-kaurene oxidase) 898 770 942 2e-12 4e-16 4e-13 P450-1 CP02-S G11-M.F cytochrome P450-1 (GA14-synthase 914 2e-15 ggds CP02-S A12-E.F CP02-S E10-C.G geranylgeranyl diphosphate synthase 538 909 1e-21 2e-17 P450-2 CP02-S G08-C.F P450II GA20 oxidase 1041 2e-16 GfCPS/KS CP02-S H11-C.F GfCPS/KS [Gibberella fujikuroi] 1019 1e-09 P450 -3 CP02-S G06-L.H cytochrome P C13 oxidase) 569 3e-20 DELLA BINT-RT B09-E.F BIEM-NT F10-E.F GIA/RGA-like gibberellin response modulator 657 894 2e-42 4e-43 Cdc2 BINT-SP A07-E.F BINT-SP B02-E.F putative receptor-like serine-threonine protein kinase 624 527 4e-68 1e-53 GID1 receptor BINT-SP C09-E.F Gibberellin receptor GID1 (Gibberellin-insensitive dwarf protein 1) 8e-14 Marcar os reads repetidos p p450 por ser uma familia muito ampla (geralmente são multifuncionais) dificultando as analises

22 Introdução CPS-KS G4 des GGPP 276 42 505 952 aa Contig8670 Contig15446
182 CPS-KS 22 1 342 aa 278 G4 des Contig13951 Contig2062 Colocar fotos do gel. Falar do sequenciamento p confirmação dos genes. 1 4 392 aa 333 GGPP Contig14680 Contig7333

23 Manejo de nitrogênio na lavoura de cacau - Edvaldo
Introdução Manejo de nitrogênio na lavoura de cacau - Edvaldo A adubação das plantas de cacau com uréia poucas semanas antes do pico de esporulação do fungo é uma das principais práticas desenvolvidas. Lavoura de Edvaldo Lavoura do vizinho

24 Regulação da síntese de giberelina
Introdução Regulação da síntese de giberelina . Nitrogênio AREA (NIT2) GAs

25 Introdução

26 Hipótese de trabalho M. perniciosa na fase é capaz de sintetizar giberelina que deve produzir um desbalanço hormonal no cacaueiro criando as condições favoráveis para o estabelecimento do fungo e o desenvolvimento da doença. Testar a hipótese formulada é algo fundamental para a compreensão da doença Vassoura-de-bruxa. Se ela for verdadeira, teremos conseguido a chave para o controle do problema através do manejo do nitrogênio na planta.

27 Estudos de complementação de mutantes funcionais
Mapeamento físico Quantificação da produção de giberelina durante a interação e a partir de sobrenadante do fungo (biotrofico e necrotrofico) Analise de expressão dos genes em diferentes fases do ciclo de vida (esporos, micelio biotrofico e micelio necrotrofico) Estudos de complementação de mutantes funcionais OBJETIVOS

28 METODOLOGIAS Pulse field e Southern blot
Cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massa (GC-MS) Real -Time PCR Falar do q já foi feito e das dificuldades. Colocar o protocolo Gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS)

29 METODOLOGIAS Complementação de mutantes (Transformação dos mutantes de G. funjikuroi ) - Race – PCR - Screening dos genes da síntese de GA em biblioteca de M. perniciosa em fago lambda EMBL3/BamH I Figura RACE

30 RACE - PRC

31 RACE - PRC PCR  Hind III 5’ / CPS-KS (1) 5’ / CPS-KS (2)
3 4 5 6 7 8 1 2 3 4 5 6 7 8  Hind III 5’ / CPS-KS (1) 5’ / CPS-KS (2) CPS-KS (3) / 3’ 5’ / G4 (1) G4 (2) / 3’ 5’ / GGPP (1) GGPP (2) / 3’

32 RESULTADOS PRELIMINARES
Teste expressão  Hind III cDNA necrotrófico cDNA biotrófico DNA genômico Controle negativo G4-des GGPP 1 2 3 4 6 5 9 7 8

33 RESULTADOS PRELIMINARES
Teste expressão 1 2 3 4 6 5 9 7 8  Hind III cDNA necrotrófico cDNA biotrófico DNA genômico Controle negativo G4-des CPS-KS

34 Screening de biblioteca de fagos com sonda CPS-KS
RESULTADOS PRELIMINARES Screening de biblioteca de fagos com sonda CPS-KS O vai fazer c isso

35 RESULTADOS PRELIMINARES
Identificação e quantificação de giberelinas durante interação - Extratos de plantas diferentes (resistente e susceptível) - Diferentes partes da planta - Diferentes estádios Identificação e quantificação de giberelinas do sobrenadante - colaboração com grupos de pesquisa da Argentina

36 RISCOS A expressão gênica não é evidencia de que o fungo produza o composto ativo Complexidade da caracterização de hormônios vegetais (em especial de giberelinas) devido à diversidade de precursores e de rotas biossíntéticas No Brasil não existem grupos estabelecidos com experiência na quantificação e identificação de giberelinas e existem poucos grupos com essa especialidade no mundo