Estudo do metabolismo peroxissomal no fungo Moniliophthora perniciosa e seu possível papel na vassoura-de-bruxa do cacaueiro. Aluno: Bruno Vaz de Oliveira.

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1 Estudo do metabolismo peroxissomal no fungo Moniliophthora perniciosa e seu possível papel na vassoura-de-bruxa do cacaueiro. Aluno: Bruno Vaz de Oliveira Orientador: Prof. Dr. Gonçalo Amarante Guimarães Pereira Co-orientadora: Dra. Johana Rincones Pérez

2 Introdução Objetivos Resultados Próximas etapas
Sumário Introdução Produção de oxalato pelo Fungo Moniliophthora perniciosa Degradação da pectina da parede vegetal Metabolismo de metanol em fungos Relação entre os metabolismos de pectina e metanol Objetivos Resultados Próximas etapas

3 Produção de oxalato pelo Fungo Moniliophthora perniciosa
Introdução Produção de oxalato pelo Fungo Moniliophthora perniciosa

4 Introdução Do Rio et al (2008)

5 Cristais secretados são realmente compostos por oxalato de cálcio
Introdução Do Rio et al (2008) Cristais secretados são realmente compostos por oxalato de cálcio

6 Introdução Oxaloacetato acetilhyrolase (Mp_oah) no genoma e expresso no micélio biotrophic-like Do Rio et al (2008)

7 OAH: enzima relacionada à produção de oxalato em vários fungos
Introdução OAH: enzima relacionada à produção de oxalato em vários fungos Han et al (2007) Disrrupção do gene oah em Botryotinia fuckeliana: não produz oxalato Complementação de linhagem mutante de A. niger oah- com o gene de B. fuckeliana: restauração do fenótipo

8 Degradação da pectina da parede vegetal
Introdução Degradação da pectina da parede vegetal

9 Metabolismo de metanol em fungos
Introdução Metabolismo de metanol em fungos Metabolismo peroxissomal Enzimas envolvidas: álcool oxidase e catalase

10 Organismos metilotróficos: Hansenula, Pichia e Candida
Introdução Organismos metilotróficos: Hansenula, Pichia e Candida Cladosporium fulvum: AO é um fator de patogenicidade Segers et al (2001)

11 Introdução Em M. perniciosa Crescimento do micélio necrotrófico em metanol como única fonte de carbono Identificação de uma AO putativa Identificação de duas CAT putativas Metabolismo peroxissomal ???

12 Relação entre pectina e metanol
Introdução Relação entre pectina e metanol Nagawaka et al (2005) Pichia methanolica: MOD1 e MOD2 Crescimento em pectina e ácido poligalacturônico Nagawaka et al (2005)

13 Resultados semelhantes para Candida biodinni
Introdução Nagawaka et al (2005) P. methanolica é capaz de utilizar o metanol proveniente das pectinas através do metabolismo peroxissomal. Resultados semelhantes para Candida biodinni

14 Plantas produzem metanol em seu metabolismo.
Introdução Plantas produzem metanol em seu metabolismo. Obendorf et al (1990): os radicais metil das pectinas são a principal fonte de metanol em sementes de soja. O processo de remoção dos radicais metil ocorre durante o crescimento e senescência de células vegetais. Gaffe et al (1994): processo pode ser aumentado devido à ação da enzima pectina metilesterase de organismos patogênicos

15 Em M. perniciosa Crescimento em pectina cítrica
Introdução Em M. perniciosa Crescimento em pectina cítrica Identificação no genoma pectinases (poligalacturonidases, pectato liases e pectina metilesterase) Foto: M. C. S. do RIO

16 Evidências Secreção de oxalato
Introdução Evidências Secreção de oxalato Crescimento do micélio em meio contento metanol ou pectina como fontes únicas de carbono Evidências de degradação da parede vegetal na presença de hifas do fungo Identificação de uma AO putativa Identificação de duas CAT putativas Identificação de uma PME putativa

17 Hipótese Hifa de M. perniciosa Peroxissomo AO CAT Metanol H2O2
H2O + O2 + Formaldeído PME Oxalato (OAH) Ca+2 Ca+2 Pectina-Ca+2 Pectina Poligalacturonato + metanol CAT H2O + O2 H2O2 Parede celular vegetal

18 Os objetivos do presente projeto são:
a caracterização das enzimas álcool oxidase e catalase, provavelmente relacionadas ao metabolismo de metanol, as quais podem caracterizar um metabolismo peroxissomal no fungo M. perniciosa, durante sua interação com Theobroma cacao no desenvolvimento da Vassoura-de-bruxa. a caracterização de outras possíveis catalases, que poderiam ser importantes na degradação de peróxido de hidrogênio liberado pela planta na tentativa de conter a infecção pelo fungo. analisar se de fato a produção de oxalato pelo fungo está relacionada à degradação das cadeias pécticas das células vegetais e à liberação de metanol.

19 Objetivos específicos
Finalizar o sequenciamento dos genes que codificam AO e CAT e analisar suas seqüências Imunolocalização das enzimas AO e CAT, através da técnica de immunogold. Estudo da expressão, in vitro e in planta Detecção das atividades AO e CAT in situ. Detecção das atividades AO em meio de cultura. Expressão heteróloga do gene que codifica AO e caracterização da proteína expressa

20 Sequenciamento Ressequenciamento dos clones Clusterização
Resultados Sequenciamento Ressequenciamento dos clones Clusterização Desenho de primers para finalizar o sequenciamento

21 Resultados

22 Resultados

23 Seqüências do 454 AO completa Catalases A e B Completas
Resultados Seqüências do 454 AO completa Catalases A e B Completas Mais 3 catalases no genoma C: completamente seqüenciada D e E: parcialmente seqüenciadas

24 Álcool oxidase (Mp-ao)
Resultados Álcool oxidase (Mp-ao) Codifica para uma proteína predita de 631 aa Ausência da seqüência sinalizadora PST1 (peroxisome targeting signal) na porção c-terminal: S/A-K/R-L//F Ausência da seqüência sinalizadora PST2 na porção N-terminal M.perniciosa PHAPVPHAPVPTGKPATQQLR- 631 G.trabeum PHAPVPHAPVPTGRPATQQPKH 651 C.cinerea PHAPVPHAPIPTGKPTTQLVR- 610 P.angusta LDMTIPNFRLGT-YEETGLARF 664 P.pastoris LDMTVPQFKLGT-YEKTGLARF 663 C.fulvum LDMRVPDYQAN--REITGLARL 665

25 Daniel, Volc et al., 2007 AO do fungo Gleophylum trabeum
Resultados Daniel, Volc et al., 2007 AO do fungo Gleophylum trabeum Secretada para o meio extracelular Daniel, Volc et al., 2007 Segers et al (2001)

26 AO de M. perniciosa: secretada???
Resultados Daniel, Volc et al., 2007 M.perniciosa PHAPVPHAPVPTGKPATQQLR- 631 G.trabeum PHAPVPHAPVPTGRPATQQPKH 651 C.cinerea PHAPVPHAPIPTGKPTTQLVR- 610 P.angusta LDMTIPNFRLGT-YEETGLARF 664 P.pastoris LDMTVPQFKLGT-YEKTGLARF 663 C.fulvum LDMRVPDYQAN--REITGLARL 665 AO de M. perniciosa: secretada???

27 Catalases 5 seqüências possivelmente codantes para catalase
Resultados Catalases 5 seqüências possivelmente codantes para catalase 3 totalmente seqüenciadas: Mp_catA, Mp_catB e Mp_catC 2 parcialmente seqüenciadas: Mp_catD e Mp_catE Comparação com seqüência se outros organismos: inferir sobre suas possíveis funções biológicas

28 Mp_catA Mp_catB Proteína predita de 731 aa
Resultados Mp_catA Proteína predita de 731 aa Domínio GATase1_catalase (cd03132) Alta similaridade com “spore specific catalases”: Aspergillus nidulans (CAT A), Neurospora crassa (CAT 1), Cryptococcus neoformans (CAT 2) Mp_catB Proteína predita de 718 aa Alta similaridade com catalases envolvidas na degradação de peróxido exógeno: Aspergillus nidulans (CATB), Neurospora crassa (CAT 2) Possivelmente secretada: peptídeo sinal na porção N-terminal

29 Mp_catC Proteína predita de 511 aminoácidos
Resultados Mp_catC Proteína predita de 511 aminoácidos Não possui domínio ligado à oligomerização Seqüência PST1 Alta similaridade com catalases peroxissomais de Sclerotinia sclerotiorum e Aspergillus nidulans (CAT C): geralmente envolvidas na degradação de peróxido endógeno A.capsulatus TEALVAS-----QAQSQSRL E.nidulans GKRIEKATEKKAT EARARL S.Sclerotiorum GSKIEEATEKLAPAPNSKAAGAAQSRL M.Perniciosa SDRIAKAVGHSQVKPLQFKPAPEAVRFKANCGAFSKL 511

30 Mp_CatD e Mp_CatE: parcialmente seqüenciadas
Resultados Mp_CatD e Mp_CatE: parcialmente seqüenciadas Alta similaridade com Mp_CatB Finalização do seu sequenciamento Parálogos?? Mp_catD PGHVVPGIDFSDDPLLQGRLFSYVDTQLNRNMGSPNFEQIPINRPRNGPPHNNNRDGAGQ 260 Mp_catE PGHVVPGIDFSDDPLLQGRLFSYVDTQLNRNMGSPNFEQIPINRPRN-SVHNNNRDGAGQ 241 Mp_CatB PGHVVPGIDFSDDTLLQGRLLSYVDTQLNRNMGSPNFEQIPINRPHV-PVHNNHRGGAGQ 415 *************.******:************************: . ***:*.**** Mp_catD QFIFSNINPYTFNTLNNGFPKPANQTVGNGFFTAPARRIVDARYVREISPTFLDFYSQPR 320 Mp_catE QFIHSNTNPYTFNTLNNGYPKPANQTTGNGFFSAPARRIVDAQYVREVSPTFIDYWSQPR 301 Mp_CatB QFIHSNIYPYTPNTLNNGSPQPANQTVGNGFFTAPARRITDARYVRELSPTFSDHWSQPR 475 ***.** *** ****** *:*****.*****:******.**:****:**** *.:**** Mp_catD LFYNSILPAERQMVINALRFELSHVQSSSVKANFINQINKVDNDLAVRVASAIGVKRPAP 380 Mp_catE LFYNSILPEERQMVINALRFELSHVQSSAVKANFINQINKIDNDFAVRVALAINVEAPSP 361 Mp_CatB LFWNSILPDEQQMIVNAFRFELARIQSAHVKSNFIAQLNRIDNGLARRVASAVNVQAPEP 535 **:***** *:**::**:****:::**: **:*** *:*::**.:* *** *:.*: * *

31 RT-PCR semi quantitativo
Resultados RT-PCR semi quantitativo Cultivo do micélio necrotrófico por 7 dias em MYEA Indução por 24 horas com Metanol, P0 e P90 Extração de RNA e Síntese de cDNA Amplificações : Mp-pme, Mp-ao, mp-catA e mp-catB

32 Resultados

33 Resultados

34 A partir dos Rt-PCR Resultado preliminar Ensaios futuros
Resultados A partir dos Rt-PCR PME: controle e P90 AO: controle, metanol e P90 Cat A: controle, metanol e P90 Cat B: nenhuma condição Resultado preliminar Ensaios futuros Real Time PCR Outras condições: ácido oxalacético, P0, P90, metanol, peróxido de hidrogênio, extrato de cacau, aminotriazole Micélio biotrophic-like

35 Obtenção de cortes ultrafinos
Resultados Obtenção de cortes ultrafinos Cultivo do micélio necrotrófico por 7 dias em MYEA Paraformaldeído 3% em tampão fosfato pH 7 por 48 horas. Desidratado em um gradiente crescente de etanol (70 a 100%) Rresina Lowcryl K4M por 2 dias, polimerização por 5 dias Trimagem e cortes ultrafinos Contraste com citrato de chumbo e acetato de uranila MET

36 Resultados

37 Detecção da atividade AO
Resultados Detecção da atividade AO Meio de cultura e extrato protéico Provável atividade AO extracelular

38 Teste de manutenção da fase biotrófica
Resultados Teste de manutenção da fase biotrófica 50mL/L de glicerol 2,5 g/L de K2HPO4 1 mL/L de trace minerals, 5 mg/L de cafeína 10 mg/L de auxina NaNO3 Manutenção por aproximadamente 3 meses

39 Resultados Após 6 meses em cultura

40 Clamidiospóros: estruturas relacionadas à resistência a estresse
Resultados Clamidiospóros: estruturas relacionadas à resistência a estresse

41 Resultados

42 Finalização do sequenciamento dos genes Mp_CatD e Mp_CatE
Próximas etapas Finalização do sequenciamento dos genes Mp_CatD e Mp_CatE Análise filogenética das catalases de M. perniciosa Imunolocalização das enzimas álcool oxidase e catalase. Estudo da expressão, in vitro, dos genes OAH, PME, AO e CAT .Estudo da expressão, in planta, dos genes OAH, PME, AO e CAT Detecção das atividades AO e CAT in situ. Expressão heteróloga do gene que codifica AO e caracterização da proteína expressa Purificação (ou expressão heteróloga) das catalases e sua caracterização