A prokaryotic alternative oxidase present in the bacterium Novosphingobium aromaticivorans Pal Stenmark, Par Nordlund FEBS Letters 552 (2003) 189-192.

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1 A prokaryotic alternative oxidase present in the bacterium Novosphingobium aromaticivorans Pal Stenmark, Par Nordlund FEBS Letters 552 (2003) 189-192

2 Introdução A AOX Ocorrência: Todas as plantas superiores, alguns fungos, tripanossomas e na bactéria N. Aromaticivorans. Funções: Transferir diretamente elétrons da ubiquinona reduzida para o oxigênio; Em algumas plantas volatilizar aminas para atrair polinizadores; Evitar formação de ROS, pelo acumulo de ubiquinona reduzida quando a via principal estiver bloqueada, ou quando a carga energética estiver alta; Plasticidade metabólica, balanceando o metabolismo de carbono e o transporte de elétrons.

3 Introdução

4 Regulação:

5 Introdução Regulação: Em plantas, a enzima é homodimérica e tem sua atividade aumentada pela redução das pontes dissulfeto entre as sub-unidades; É também estimulada por α-ceto ácidos, especialmente o piruvato, o qual reage com grupos sulfidrilas da porção N-terminal da proteína; Em fungos, a enzima é monomérica e não é estimulada por α-ceto ácidos, porém é estimulada por ADP, AMP e GMP.

6 Introdução Regulação:

7 Introdução

8 Materiais e Métodos Clonagem e expressão: A AOX de N. aromaticivorans (NaAOX) foi clonada no plasmídio pUNI-10, originando o vetor pUNI-NaAOX. pUNI-NaAOX foi então recombinado com o vetor de alto nível de expressão pHB-MALc2X e e ao de baixa expressão pHB-MALc2M, originando os vetores de expressão pNaAOX-C2X e pNaAOX-C2M, ambos com proteína de fusão MPB Ensaio de complementação: Bactérias E.coli heme-deficientes (SASX41B) foram transformadas pelos vetores de expressão e induzidas por IPTG.

9 Materiais e Métodos Regulação da NaAOX em N. aromaticivorans A expressão da NaAOX foi medida por Western blot, usando um anticorpo para a AOX de S. guttatum Foram analisadas culturas de N.aromaticivorans em meios com glicose ou lactose, com e sem agitação para modular diferentes níveis de oxigênio

10 Resultados e Discussão Atteia, A et al. 2003

11 Resultados e Discussão A NaAOX possui 229 aminoácidos; Possui 58% de similaridade com a AOX de A. thaliana, não incluindo ~134 aminoácidos na porção N-terminal; Não possui a cisteína regulatória; Pelo tamanho reduzido, deve possuir os atributos mínimos para uma AOX funcional.

12 Resultados e Discussão Aparentemente a indução da construção de alto nível de expressão por IPTG levou ao estresse das células, impedindo a formação de colônias; Bactérias portando essa construção expressaram a NaAOX em altos níveis quando induzidas em meio LB líquido.

13 Resultados e Discussão

14

15 Durante o ciclo de vida, a bactéria é exposta a condições nas quais as oxidases normais são inibidas; Juntamente com o o Complexo I, a AOX possibilitaria o bombeamento de prótons quando tais oxidases estivessem inibidas; O aumento dos níveis da NaAOX em condições de baixa concentração de oxigênio, indica que a proteína não atua simplesmente na eliminação do excesso de oxigênio celular;

16 Resultado e Discussão Como N. aromaticivorans utiliza muitos compostos como fonte de carbono e energia e a glicose possui maior energia do que a lactose, a NaAOX deve atuar balanceando o metabolismo de carbono e o transporte de elétrons; A alta similaridade entre a AOX de N. aromaticivorans e a de plantas é um forte indício que o gene tenha sido adquirido diretamente de plantas por transferência horizontal; Outro indicio forte de transferência horizontal é a existência de espécies do gênero Novosphingobium que têm plantas como habitat.