ELETROFORESE GEL DE POLIACRILAMIDA

GEL DE POLIACRILAMIDA PARA ANÁLISE DE ÁCIDOS NUCLEICOS Os géis de poliacrilamida são usados para separação de proteínas e pequenos fragmentos de DNA e RNA (cerca de 5 a 500 pb). A poliacrilamida também pode ser usada quando pequenas quantidades de DNA ou RNA são analisadas ou quando é necessária uma maior resolução do que a obtida com o uso de géis de agarose.

Principais vantagens do uso de géis de poliacrilamida São formados por poros mais regulares e de tamanho uniformes Permite a aplicação de maiores quantidades de amostra; ate 10 ug de DNA podem ser aplicados, por exemplo, em um único poço sem perda significativa de resolução. São géis utilizados para a recuperação e a purificação de DNA e RNA, devido à relativa pureza de seus ingredientes. A acrilamida é uma matriz de gel mais resistente que a agarose, portanto, não quebra facilmente.

Características O gel de poliacrilamida é formado por um monômero de acrilamida (CH2=CH-CO-NH2) e por um cross-linker que copolimerizam em longas cadeias com ligação cruzadas covalentes. Dessa forma, é mais difícil de ser preparado e mais tóxico tanto em pó quanto em solução, relação à agarose.

Características O tamanho do poro do gel é determinado pela porcentagem total de acrilamida (entre 3,5 e 20%) e pela razão desta em relação a bisacrilamida, em geral um molécula de bisacrilamida para cada 29 monômeros de acrilamida. Caso as amostras a serem analisadas contenham uma mistura de ácidos nucleicos com grande variedade de peso molecular, é possível usar um gel com gradiente de concentração. Nesses géis, o topo apresenta poros de maior tamanho em relação aos da base do gel, tornando a corrida eletroforética mais restrita.

Materiais utilizados: Cuba de eletroforese vertical; Placas de vidro, espaçador, grampos e pente para a montagem de um gel; Provetas; Pipetas graduadas; Pipetas semi-automáticas e ponteiras; Acrilamida a 40%; APS 10%; TMED; TBE 10x; Tampão de carregamento de amostra.

Preparo do gel Desengordurar as placas de vidro. Montar as placas utilizando grampos e espaçadores. Pipetar os seguintes reagentes: Reagentes Volumes ddH2O 17,0 ml Acrilamida a 40% 5,0 ml TBE 10x 2,5 ml APS 10% 50 µl TMED 30 µl Volume final 24,78 ml

Colocar a placa montada em uma superfície plana e aplicar todo volume. Colocar o pente após a aplicação do gel e aguardar por alguns minutos a polimerização. Retirar o pente e montar a placa na cuba eletroforética. Pipetar em cada poço 4 µl de amostra + 6 µl de tampão de carregamento de amostra. Ligar a fonte e colocar para correr a 100 w, 70 mÅ por 1’ 30”.