Revisão imuno clínica – aula 1 Prof. Ms. Aline Helen Corrêa Garcia

Células do Sistema Imune Linfócitos NK Células Dendríticas Macrófagos e Monócitos Neutrófilos Eosinófilos Mastócitos Basófilos

Linfócitos São as únicas células com receptores específicos para antígenos Chaves da imunidade adaptável. Morfologicamente semelhantes São heterogêneos em: Linhagem Funcionamento Fenótipo Capacidade de respostas e atividades biológicas complexas e atividades.

Linfócitos B São as únicas células capazes de produzir anticorpos Imunidade humoral. Expressão de anticorpos Receptores que reconhecem antígenos Antígenos solúveis e antígenos na superfície de micróbios e outras células Ativação celular Resposta imune humoral.

Linfócito T Imunidade Celular Receptores reconhecem fragmentos de peptídeos de ag Ligados a major histocompatibility complex (MHC) ou complexo de histocompatibilidade principal (MHC). T CD4+ = helper ou auxiliares Ajudam B a produzir anticorpos Fagócitos a destruir micróbios fagocitados T CD8+ = citotóxicos ou citolíticos Destroem células que abrigam micróbios intracelulares

Linfócitos NK NK = Natural Killer ou assassina natural Mediadores de imunidade inata Não expressam receptores de antígeno como as células B ou células T. Importante contra vírus e tumores

Células Apresentadoras de Antígenos ou Antigen Presenting Cells -APCs Portas de entrada para micróbios a pele, área gastrointestinal e área respiratória, Contêm células especializadas localizadas abaixo do epitélio que captura Ag e os transporta para tecidos linfóides. Células dendríticas e macrófagos

Células Dendríticas A função de APC é melhor representada pelas células dendríticas Nome por causa dos processos dendríticos longos. Capturam ag protéicos Exibem partes dos Ags para os linfócitos T Pele: células de Langerhans

Macrófago

Macrófagos Célula grande com vacúolos citoplasmáticos Apresenta diferentes nomes, de acordo com o tecido Presente em tecidos saudáveis Fagocitose Apresentação de antígenos

Macrófago + pseudopodes

macrófago interagindo com vários linfócitos

Leucócitos Polimorfonucleares ou granulócitos Possuem inúmeros grânulos no citoplasma Núcleo irregular Neutrófilos Menor que o macrófago, não presente em tecidos saudáveis Fagocitose Eosinófilos Defesa contra parasitas e vermes Mastócitos/Basófilos Alergias

Núcleo bilobado/reniforme Núcleo multilobulado Núcleo em forma de ferradura

Leucócito PMN Neutrófilo

Hematopoiese

Órgãos e Tecidos do Sistema Imune

Órgãos Linfóides sangue Linfócitos Tecidos especializados

Órgãos Linfóides Órgãos linfóides primários ou centrais Maturação de linfócitos (TCR e BCR) Timo e medula óssea Órgãos linfóides secundários ou periféricos Resposta imune Baço, linfonodos, placas de Peyer. Amigdala, etc

Timo Bilobulado Mediastino anterior Maturação de linfócitos T Cada lobo se divide em múltiplos lóbulos, e cada lóbulo é dividido em córtex e medula Mediastino anterior Maturação de linfócitos T

Timo Seleção tímica TCR CD4 ou CD8 Maturação de linfócitos T principalmente no período fetal e depois do nascimento 90-95 % dos timócitos entram em apoptose Ausência de Timo: falta de células T

Medula óssea e Bursa de Fabricius

Órgãos Linfóides Periféricos Linfonodos, baço,placas de Peyer e os tecidos linfóides associados a mucosa (BALT, GALT) Onde os linfócitos encontram os antígenos e onde se inicia a resposta imune Estes tecidos estão conectados através dos vasos linfáticos - Linfa

Linfonodos Agregados ovóides de tecido linfóide localizados ao longo de canais linfáticos no corpo. Transporta fluido chamado linfa dos epitélios, tecidos conjuntivos e da maioria do órgãos parenquimatosos é escoado por vasos linfáticos dos tecidos para os linfonodos. A linfa é uma mistura de substâncias que são absorvido nos epitélios e tecidos.

A passagem da linfa no linfonodo Como as passagens de linfa por linfonodos resulta: APCs podem capturar os antígenos de micróbios que entraram pelos epitélios nos tecidos. Células dendríticas apanham antígenos de micróbios do epitélios e transportam estes antígenos para linfonodos pela linfa. O resultado líquido destes processos: captura, transporte e concentração dos Ags que entram por epitélios ou tecidos colonizados que escoam para os linfonodos.

Recirculação de linfócitos Linfócitos circulam nos tecidos Linfócito virgem Órgãos linfóides Linfócito efetor Locais de infecção é melhor descrito melhor para T. T citotóxico em qualquer local de infecção. B permanecem em órgãos linfóides não precisam migrar para locais de infecção. Secretam anticorpos Ac entram no sangue Micróbios de achado e toxinas microbianas na circulação ou tecidos distantes.

O baço Órgão abdominal É o principal local de produção de Ac Mesmo papel em respostas imunes para antígeno sanguíneos Sangue que entra no baço por uma cadeia de canais (sinusóides) forrada de fagócitos. Apanham antígenos e os concentra células de dendríticas e macrófagos.

O baço Polpa branca Polpa vermelha Rica em linfócitos Local onde hemácias são removidas

MALT e GALT Sistemas linfóide debaixo dos epitélios da pele, do trato gastro-intestinal e áreas respiratórias Amígdalas e placas de Peyer são MALT São locais de respostas imunes a antígenos que superam a barreira epitelial

ANTÍGENOS e IMUNÓGENOS

Definição São substâncias químicas capazes de induzir resposta imune específica, pois são estranhas ao sistema imune, normalmente induzem a formação de anticorpos ou de resposta celular, ou ambas

Antígeno é toda a estrutura capaz de reagir com as células do sistema imune (fagócitos, linfócitos T e B)‏.É qualquer molécula que possa ser reconhecida pelos elementos do sistema imune inato (inespecífico) ou adaptativo (específico).‏

 Imunógenos Antígenos Funcional Antígenos e Imunógenos Agente capaz de se ligar especificamente à componentes da resposta Imunológica  Imunógenos Antígenos Agente capaz de induzir resposta Imunológica Funcional

Características: Imunogenicidade é a capacidade de induzir resposta imune específica Antigenicidade é a capacidade de interagir com anticorpos (Ac) ou linfócitos T (ly T) sensibilizados Obs: imunógeno: substância que possuí epítopos estranhos ao organismo, são substâncias ativadoras específicas) (depende de quanto a substância é estranha ao organismo)‏

“TODO IMUNÓGENO é um ANTÍGENO. Nem TODO ANTÍGENO é IMUNÓGENO.”

Determinante Antigênico ou Epítopo - É a menor porção da molécula antigênica responsável pela propriedade de estimular a produção dos anticorpos, são responsáveis pela interação com o sítio combinatório de anticorpo ou do receptor de antígeno (TCR) de lyT - Tamanho médio de 7x14x34u, correspondendo a 4-6 resíduos de aminoácidos - Cada antígeno pode conter um ou mais epítopos, sendo iguais ou diferentes - uma única molécula antigênica normalmente possui vários epítopos diferentes

Epítopo  é a menor porção de antígeno com potencial de gerar a resposta imune. É a área da molécula do antígeno que se liga aos receptores celulares e aos anticorpos. proteína açúcar bactéria

Epítopos de linfócitos B ligam-se a moléculas de imunoglobulina não necessitam de processamento por APC´s estão localizados na superfície das proteínas 3 a 20 resíduos de aminoácidos ou carboidratos

Epítopos lineares Formados por resíduos dispostos seqüencialmente de maneira linear em um antígeno protéico ou polissacarídico Não são afetados por nenhum tratamento que altere a estrutura tridimensional da substância

Epítopos conformacionais Formados pelas estruturas secundária, terciária ou quaternária de uma proteína Formados pelo dobramento tridimensional normal de um polissacarídeo Eles perdem funções de epítopos se desnaturados

Epítopos de linfócitos T Ligam-se ao TCR após processamento, quando ligados a moléculas de MHC (Complexo Principal de Histocompatibilidade) presentes nas APCs. Molécula imunogênica - pelo menos um epítopo de célula T. Resíduos imunodominantes - presentes dentro de um epítopo - interagem com maior afinidade de ligação - podem induzir uma resposta mais forte.

Antígenos T-independentes Possuem a capacidade de estimular células B a produzirem Ac, sem a necessidade da ativação do linfócito TH – co-estímulo São polímeros com numerosos determinantes antigênicos repetidos. não produzem memória imunológica

Haptenos Composto de baixo peso molecular. Pouca complexicidade. Sozinho não promovem resposta imune Ligação covalente a carregadores – indução de resposta. O complexo hapteno-carreador comporta-se como um epítopo de célula B. Não são imunógenos - quando acoplados a proteínas carreadoras tornam-se imunógenos, produzindo resposta imune, isto é, são capazes de combinar-se com a molécula de anticorpo, mas não são capazes de estimular resposta imune, a menos que estejam associados com uma molécula carreadora imunogênica

Exemplos: a insulina, a penicilina, os lipídeos, os ácidos nucleícos, a anilina e o aminobenzeno.

Antígenos Celulares Importantes 1) Antígenos de Histocompatibilidade As células T reconhecem como estranhos os peptídeos ligados a proteínas de superfície, que provocam resposta imune se transferidas para outro indivíduo da mesma espécie (alogênico). Algumas dessas proteínas, muito imunógenas, são glicoproteínas e constituem o Principal Complexo de Histocompatibilidade (MHC – major histocompatibility complex ou sistema HLA – human leukocyte antigens) é um complexo de genes capaz de causar rejeição a enxertos.

2) Antígenos Eritrocitários Herdados geneticamente, são antígenos (oligossacarídeos) presentes na superfície das hemácias e de outros fluídos corpóreos. Tem grande importância, pois relacionam-se as transfusões (Sistema ABO)‏

Resultado positivo Ag eritrocitário Ac Anti-eritrócito Reagente de Coombs

Natureza química dos Antígenos (Ag) Inorgânicos: não são imunógenos Proteínas: são fortes imunógenos Polissacarídeos: raramente são bons imunógenos *Lipídios: simplicidade estrutural - comuns *Carboidratos: pequenos, pouco imunógenos *Ácidos nucleicos: de relativa simplicidade e rápida degradação, não funcionam como imunógenos *ligação com carreador melhora a imunogenicidade

Classificação peptídeos, polímeros de aminoácidos molécula quimicamente sintetizada Sintético iodo-proteínas, haptenos-proteínas natural modificado quimicamente Artificial proteínas, toxinas, glicoproteinas plantas, bactérias, vírus, fungos, animais Natural Exemplo Origem Classe

Fatores que influenciam imunogenicidade 1. Relação filogenética entre doador e receptor self x non-self :maior distância filogenética (relação biológica) = maior imunogenicidade Aloantígenos: substâncias que apresentam alguns determinantes antigênicos diferentes em indivíduos da mesma espécie. Ex:MHC e Ag Eritrocitários 2. Degradabilidade: substâncias instáveis e muito degradáveis não são bons imunógenos

3. Complexidade molecular:  complexa  imunognicidade 4.Tamanho:  tamanho número de epítopos - melhor resposta imune 5. Acessibilidade: exposição dos ag para linfócitos T ou B 6. Configuração espacial da molécula: depende da estrutura primária e determina especificidade imunológica 7. Via de Imunização e Dose do Antígeno: esquema de imunização Vias de Inoculação: facilita o processo inflamatório e imune

8. Hospedeiro respondedor - herança genética (bons e maus respondedores)‏ - idade - estado nutricional - infecções concomitantes - competência do sistema imune

Adjuvantes Adjuvantes são substâncias que podem aumentar a resposta a um imunógeno se for administrado junto a este. Isto pode ser feito prolongando a retenção do imunógeno, estimulando migração de células do sistema imunológico ou através da produção local de citocinas. Adjuvante de Freund: é o bacilo da tuberculose morto incorporado a uma emulsão de água e óleo Sulfato de Alumínio: precipita Ag e este precipitado quando inoculado, induz resposta imune

Trabalho : 1) Diferencie antígeno e imunógeno, imunogenicidade e antigenicidade. 2) Discuta a frase: “Todo imunógeno é um antígeno. Nem todo antígeno é um imunógeno.” 3) O que são e quais são os Ag naturais? Qual a importância de seu estudo e caracterização? 4) Indique e explique os fatores que interferem na imunogenicidade de um antígeno. 5) O que são epítopos, quais os tipos existentes e qual a sua importância e forma de ação? 6) Caracterize a ação de haptenos ligados a carreadores e explique por que sozinhos não são imunogênicos. Quais as vias de ação dos adjuvantes? Para melhor memorização, faça um esquema mostrando a hematopoiese. Quais as carcteristicas dos antígenos T –independentes? O que são alógenos e qual a sua relação com MHC? Cite os antígenos heritrocitários (ABO) relacionando-os com os grupos sanguíneos e as transfusões.

Anticorpos Imunoglobulinas (Ig)  Moléculas de glicoproteína que são produzidas pelos plasmócitos em resposta a um imunógeno e que funcionam como anticorpos. FUNÇÕES GERAIS DAS IMUNOGLOBULINAS A. Ligação a antígeno  Imunoglobulinas se ligam especificamente a um ou a alguns antígenos proximamente relacionados. Cada imunoglobulina na verdade liga-se a um determinante antigênico específico.

B. Funções Efetoras  Freqüentemente a ligação de um anticorpo a um antígeno não tem efeito biológico direto. Ao invés disso, os efeitos biológicos significantes são uma conseqüência de “funções efetoras” secundárias de anticorpos.  1. Fixação ao complemento – Isso resulta na lise de células e liberação de moléculas biologicamente ativas . 

2. Ligação a vários tipos celulares – Células fagocitárias, linfócitos, plaquetas, células master, e basófilos têm receptores que se ligam a imunoglobulinas. Essa ligação pode ativar as células que passam a realizar algumas funções. - Algumas imunoglobulinas também se ligam a receptores em trofoblastos placentários

Estrutura básica das imunoglobulinas -cadeias leves e pesadas Pontes dissulfeto Regiões Variáveis (V) e Constantes (C)  - Região da dobradiça  - Domínios Carboidratos

FRAGMENTOS DE IMUNOGLOBULINA: RELAÇÕES ESTRUTURA/FUNÇÃO Fragmentos de imunoglobulinas produzidos por digestão proteolítica têm-se mostrado úteis na elucidação das relações de estrutura e função em imunoglobulinas. A.  Fab  Digestão com papaína quebra a molécula de imunoglobulina na região da dobradiça antes da ponte dissulfeto intercadeia Figura 4. Isso resulta na formação de dois fragmentos idênticos que contém a cadeia leve e os domínios VH e CH1 da cadeia pesada.

B. Fc  Digestão com papaína também produz um fragmento que contém o restante das duas cadeias pesadas, cada uma contendo um domínio CH2 e CH3. Esse fragmento foi chamado Fc porque é facilmente cristalizado.

Funções dos fragmentos dos anticorpos (Fab e Fc) Ligação com o antígeno específico É constituído de uma cadeia leve e de uma porção da cadeia pesada, ambas possuindo um domínio constante e outro variável Fc Promove a ação efetora do anticorpo, pois interage com outras células e/ou proteínas do sistema imunológico

Isotipos / Alotipos / Idiotipos São as diferentes classes de anticorpo ex: IgA, IgD, IgE,IgG e IgM Alotipos São os isotipos de indivíduos diferentes ou espécies diferentes, devido a alterações na cadeia constante Idiotipos São alterações nos domínios variáveis dos anticorpos de mesma classe (especificidade)

Principais funções dos anticorpos Neutralização Microrganismo Toxinas Opsonização Citotoxidade celular dependente de anticorpo (ADCC) Ativação do complemento OBS: Para o desencadeamento dessas funções é necessário que os anticorpos estejam ligados a alguma superfície (exceto neutralização) e estejam em dupla pelo menos (exceto a IgM).

Neutralização de microrganismos e toxinas *Neutralização é a ligação dos aniticorpos aos microrganismos e/ou toxinas, impedindo a aderência e ação dos mesmos nas células do hospedeiro. ANIMAÇÕES: http://student.ccbcmd.edu/courses/bio141/lecguide/unit5/humoral/abydefense/adherence/blockadhesan.html http://student.ccbcmd.edu/courses/bio141/lecguide/unit5/humoral/abydefense/neutexo/toxin_neut.html

Opsonização e fagocitose * Opsonizar é auxiliar o processo de fagocitose pelas células fagocitárias para que os microrganismos sejam destruídos enzimaticamente. ANIMAÇÃO: http://student.ccbcmd.edu/courses/bio141/lecguide/unit5/humoral/abydefense/opsonization/opson_capsule_sum.html

ADCC (Citotoxidade celular dependente de anticorpos) *Liberação de perforinas e granzimas que ativam a via das caspases e promovem apoptose da célula infectada. ANIMAÇÃO: http://student.ccbcmd.edu/courses/bio141/lecguide/unit5/humoral/abydefense/adcc/adccanim.html

Ativação do sistema complemento (via clássica) Formação do poro na membrana do parasita… ANIMAÇÃO: http://student.ccbcmd.edu/courses/bio141/lecguide/unit4/innate/cytogn.html

Classe IgG (Localização: plasma) -São os mais abundantes no soro (70-75%) -São muito versáteis -4 subclasses: IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4 -neutralizam toxinas (todos) -Promovem ADCC -fazem opsonização (IgG1 e IgG3) -fixam a via clássica do complemento (IgG1, IgG2 e IgG3) -são os únicos que podem atravessar a placenta (IgG2) em humanos -Ligação a células – Macrófagos, monócitos, PMN's e alguns linfócitos têm receptores para a região Fc da IgG. Nem todas as subclasses se ligam com a mesma eficiência; IgG2 e IgG4 não se ligam a receptores de Fc. Uma consequência da ligação a receptores de Fc em PMN's, monócitos e macrófagos é que a célula pode então internalizar o antígeno melhor. O anticorpo preparou o antígeno para ser comido pelas células fagocitárias. O termo opsonina é usado para descrever substâncias que aumentam a fagocitose. IgG é uma boa opsonina. Ligação de IgG a receptores de Fc em outros tipos de células resulta na ativação de outras funções.  

Classe IgM (Localização: plasma, membrana das cél. B) Correspondem por cerca de 10% das Ig SÃO OS PRIMEIROS A SEREM PRODUZIDOS NA FASE AGUDA DE UMA INFECÇÃO Funcionam como receptor de antígenos na superfície dos linfócitos B virgens (naive) na forma monomérica Neutralizam toxinas Fixam a via clássica do complemento IgM é a primeira Ig a ser feita pelo feto e a primeira Ig a ser feita por uma célula B virgem quando é estimulada pelo antígeno.  IgM liga-se a algumas células via receptores de Fc.

Classe IgA Correspondem por cerca de 15-20% das Ig do soro (Localização: secreções ) Correspondem por cerca de 15-20% das Ig do soro NEUTRALIZAM TOXINAS PROMOVEM A IMUNIDADE DAS MUCOSAS ATRAVÉS DO BLOQUEIO DA LIGAÇÃO DE ANTÍGENOS (MICRORGANISMOS) a) IgA é a 2a Ig mais comum no soro. b) IGA É A PRINCIPAL CLASSE DE IG EM SECREÇÕES – LÁGRIMAS, SALIVA, COLOSTRO, MUCO. UMA VEZ QUE É ENCONTRADA EM SECREÇÕES IGA SECRETORA É IMPORTANTE NA IMUNIDADE LOCAL (DE MUCOSA). c) Normalmente IgA não fixa complemento, a menos que esteja agregada. d) IgA pode se ligar a algumas células - PMN's e alguns linfócitos.

Classe IgD Correspondem por menos de 1% das Ig do soro (Localização: plasma, membrana das cél. B) Correspondem por menos de 1% das Ig do soro Funcionam como receptor de antígenos na superfície dos linfócitos B virgens (naive)  IgD liga complemento.

Classe IgE BAIXA CONCENTRAÇÃO NO SORO   Classe IgE (Localização: membrana de mastócitos e basófilos ) BAIXA CONCENTRAÇÃO NO SORO ADCC ENVOLVENDO EOSINÓFILOS NA IMUNIDADE CONTRA HELMINTOS DEGRANULAÇÃO DE MASTÓCITOS OCASIONANDO ALERGIAS. ENVOLVIDA EM REAÇÕES ALÉRGICAS – Como consequência da sua ligação a basófilos e mastócitos, IgE é envolvida em reações alérgicas. Ligação do alergeno à IGe nas células resulta na liberação de vários mediadores farmacológicos que resulta em sintomas alérgicos. c) IgE também participa em doenças parasitárias por helmintos. Uma vez que os níveis sorológicos de IgE aumentam em doenças parasitárias, a quantificação dos níveis de IgE auxilia no diagnóstico de infecções parasitárias. Eosinófilos têm receptores de Fc para IgE e a ligação de eosinófilos a helmintos cobertos por IgE resulta na morte do parasita. d) IgE não fixa complemento.

A resposta primária e secundária A primeira resposta contra um antígeno é fraca e formada principalmente por anticorpos da classe IgM, onde depois de algum tempo ocorre mudança de isotipo e memória imunológica. A resposta secundária é bem mais intensa e composta por anticorpos das classes IgG, IgA ou IgE.

Fab Fc símbolo Sítio de ligação do Ag Molécula de Ac antígeno Determinante antigênico (epítopo)‏ Cadeia leve Cadeia pesada Fab Fc Região de dobradiça

Natureza química da interação - São forças fracas que se somam e formam complexos estáveis - Não há ligações covalentes - A interação é reversível - A interação ocorre por complementariedade entre o sítio combinatório do anticorpo (Ac) e o determinante antigênico do antígeno (Ag)

Afinidade dos Anticorpos pelo Antígeno -Define a estabilidade do imunocomplexo Ag – Ac -Melhor complementariedade entre o sítio combinatório do Ac e o determinante antigênico do Ag significa maior afinidade = maior número de interações - Exprime a capacidade de ligação do sítio combinatório do Ac específico pelo determinante antigênico - Quando a afinidade é baixa, o Ac pode interagir mais facilmente com sistemas antigênicos heterólogos (outros Ag)‏

Anticorpos de alta afinidade Reconhecem uma grande porção da estrutura do determinante antigênico específico. Anticorpos de baixa afinidade Reconhecem pequena parte da estrutura, podendo estes anticorpos reagir com moléculas que tenham estruturas semelhantes, porém com menor afinidade, ocorrendo reação cruzada

Valência e Avidez Figura 2: Avidez e Valência na Interação Antígeno-Anticorpo

Deve-se considerar que: - Cada clone de plasmócitos produz sempre moléculas de Ac com uma especficidade, mas com dois sítios combinatórios semelhantes ou idênticos (Ac é bivalente) - A complexidade da maioria dos antígenos pressupõe múltiplos determinantes antigênicos (epítopos) - Para cada epítopo há Ac específico (às vezes de várias classes)

Reação Cruzada - É a interação de um anticorpo com um antígeno (heterólogo) que não tenha sido aquele que induziu a sua formação (homólogo)‏ - Essa interação ocorre porque alguns dos determinantes: Antigênicos são semelhantes ou pelo fato de dois antígenos diferentes apresentarem o mesmo determinante antigênico Quanto maior a similaridade maior a intensidade da interação

Reação Inespecífica - Ocorrem em qualquer amostra, inclusive de indivíduos sadios - Pode ser devido a anticorpos naturais ou a substâncias metabólicas circulantes - Os anticorpos inespecíficos são chamados de “anticorpos naturais” e são considerados na padronização dos testes imunológicos através da utilização de amostras-controle obtidas de indivíduos supostamente sadios

ANTICORPOS MONOCLONAIS

Anticorpos Policlonais Os anticorpos que surge num animal em resposta a único antígeno complexo são heterogêneos . São formados vários clones diferentes de células B que diferenciam-se em plasmócitos, cada um deles expressando e secretando, respectivamente, um tipo de anticorpo, capaz de reagir com um diferente epítopo no antígeno complexo. Estes anticorpos são denominados policlonais.

Anticorpos Monoclonais Os anticorpos que surgem a partir de um único clone de células, como, por exemplo, num tumor de plasmócitos (mieloma) são homogêneos, isto é, são iguais entre si. São ditos anticorpos monoclonais.

Método de Produção de Anticorpo Monoclonal O método envolve fusão celular (ou hibridização de células somáticas), entre um linfócitos B normal produtor de anticorpo e uma linhagem de mieloma, seguindo-se subsequentemente a seleção de células fusionadas que secretem anticorpo da especificidade desejada, derivada do linfócito B normal. Tais linhagens celulares imortalizadas, produtoras de anticorpos e derivadas de fusões, são chamadas hibridomas. Os anticorpos que elas produzem são anticorpos monoclonais.

Método de Produção de Anticorpo Monoclonal Clique http://highered.mcgraw-hill.com/olcweb/cgi/pluginpop.cgi?it=swf::535::535::/sites/dl/free/0072437316/120110/micro43.swf::Monoclonal%20Antibody%20Production

Anticorpos Monoclonais A hibridização de linfócitos é o melhor método para produzir um anticorpo monoclonal contra um determinante antigênico conhecido. Este anticorpo pode ser usado para identificar antígenos desconhecidos presentes numa mistura, porque cada anticorpo é específico para apenas um determinante antigênico.

Anticorpos Monoclonais - Aplicações 1) Identificação de marcadores fenotípicos únicos para os tipos celulares individuais. A base para a classificação moderna de linfócitos e fagócitos mononucleares é a ligação de anticorpos monoclonais população específicos. Estes têm sido usado para definir moléculas típicas de cada célula.

Anticorpos Monoclonais - Aplicações 2) Imunodiagnóstico: o diagnóstico de muitas doenças infecciosas e degenerativas, depende da detecção de antígenos e/ou anticorpos específicos na circulação ou nos tecidos, usando anticorpos monoclonais em imunoensaios. Para a imunodosagem de hormônios, marcadores tumorais e de outras proteínas séricas, sempre se usa Ac. monoclonais

Anticorpos Monoclonais - Aplicações 3) Diagnóstico e terapia de tumores: Anticorpos monoclonais específicospara tumores são usados para a detecção de tumores por técnicas de imagens e para a imunoterapia.

Anticorpos Monoclonais - Aplicações 4) Análise funcional de moléculas da superfície celular e secretadas: na pesquisa imunológica, os anticorpos monoclonais que se ligam a moléculas da superfície celular e estimulam ou inibem funções celulares, são instrumentos inestimáveis para definir a função das moléculas de superfície, incluindo os receptores para antígenos. Anticorpo que neutralizam citocinas são usados para detectar a presença e os papéis funcionais destes compostos protéicos in vitro e in vivo.

Anticorpos Monoclonais - Perspectivas Técnicas de engenharia genética são usadas para expandir a utilidade dos anticorpos monoclonais, produzindo: Anticorpos humanizados; Produção de anticorpos monoclonais sem a necessidade de hibridomas;

Sistema complemento

Amostras utilizadas em Imunoensaios

INTRODUÇÃO A validação dos imunoensaios é feita com base nos parâmetros de sensibilidade, especificidade, repetitividade, reprodutibilidade e estabilidade Problemas no imunoensaio = nova amostra = problema desaparece Os imunoensaios são objeto de padronização e normatização Controle de Qualidade – pré analítico

FATORES INERENTES AO PACIENTE: Idade Sexo Etnia Gravidez PREPARO E INSTRUÇÕES AO PACIENTE FATORES INERENTES AO PACIENTE: Idade Sexo Etnia Gravidez Período de Ciclo Menstrual Uso de medicamentos (anticoncepcional, vitaminas, etc)

JEJUM Não tem muita importância para Imunoensaios. No entanto, concentração excessiva de lipídios pode interferir em teste de imunoprecipitação e aglutinação. Evitar coletar amostras até 2h após refeição (almoço, janta) – pós- prandial. Recomendável jejum padrão de 8h se for realizar também outros exames. Jejum de 4h, se somente for realizar exames de imunoensaios. Beber água não invalida o jejum. Evitar álcool, fumo (afeta os hormônios)

GRAVIDEZ Geralmente ocorre resultados falso-positivos devido mudanças hormonais e protéicos como aumento de hCG, lactogênio, cortisol e hormônios tireoidianos. Perguntar a data da última menstruação e a semana gestacional, principalmente na determinação de hormônios.

EXERCÍCIO Exercícios com perda de água e suor alteram a concentração de parâmetros bioquímicos e hormônios. Fazer 30 minutos de repouso no laboratório antes da coleta.

IDADE Importante na determinação de hormônios, proteínas e substâncias do metabolismo bioquímico.

CICLO MENSTRUAL E RITMO CIRCADIANO Deve conter no laudo o dia do ciclo menstrual. Cortisol é o parâmetro mais afetado ao longo do dia. Preconiza-se coletar entre 7:00 e 9:00h da manhã.

Laboratório de Análises Clínicas Finalidades: Verificar estágios da condição biológica humana Verificar ausência de patologias, como parte de algoritmos médicos ex.: Diabetes Mellitus (adulto)‏ Estabelecer diagnósticos Fornecer informações para diagnóstico e acompanhamento de patologias agudas e crônicas

COLETA DE SANGUE O tipo de amostra para cada analito é definido por protocolos internacionais. Evitar hemoconcetração: não deixar o torniquete por mais de 1minuto. Evitar hemólise: ruptura de hemácias. Coleta em tubo seco ou gel, e anticoagulantes (citrato, heparina, EDTA e inibidor de glicose).

AMOSTRAS COLETA É o primeiro passo para TODAS as análises efetuadas no Laboratório Clínico Todas as etapas seguintes dependem da coleta do material - É importante que o procedimento apropriado (indicado) seja seguido = para obtenção de resultados exatos - Utilizar material completamente limpo para evitar falsos resultados

OBTENÇÃO DE SORO OU PLASMA É necessário certo tempo para formação do coágulo e retração ideal. Não é aconselhável refrigerar a amostra. Após centrifugação, obtêm o soro ou plasma.

OUTROS ESPÉCIMES BIOLÓGICOS USADOS NOS IMUNOENSAIOS URINA Determinação hormonal ou de drogas Líquido Cefalorraquidiano (LCR) Pesquisa de antígenos bacterianos, virais e parasitários Pesquisa de Ac LÍQUIDO AMNIÓTICO Amniocentese procedimento para obtenção de líquido após 16ª. Semana de gestação. Não deve conter sangue. Pesquisar presença de patógenos.

OUTROS ESPÉCIMES BIOLÓGICOS USADOS NOS IMUNOENSAIOS FEZES Pesquisar a presença de antígenos SALIVA Determinação de hormônios livres: cortisol, progesterona, estradiol e testosterona; e as drogas teofilina, digoxina e diazepam. SÊMEN Pesquisa de anticorpos antiespermatozóides. Manter 3 dias de abstinência sexual. Após ejaculação aguardar 30 min, e usar o material em até 2h

Especificidade  Especificidade se refere à habilidade de um sítio de combinação de anticorpo em particular de reagir com apenas um antígeno. Em geral, há um elevado grau de especificidade nas reações antígeno- anticorpo. Anticorpos podem distinguir diferenças em 1) estrutura primária de um antígeno, 2) formas isoméricas de um antígeno, e 3) estrutura secundária e terciária de um antígeno.

PROPRIEDADES DE UM TESTE DIAGNÓSTICO ESPECIFICIDADE (E) É A CAPACIDADE DE UM TESTE DE DETECTAR OS NEGATIVOS ENTRE OS NÃO DOENTES TESTES DE BAIXA ESPECIFICIDADE RESULTAM EM MAIOR NÚMERO DE FALSOS POSITIVOS

Sensibilidade é a

PROPRIEDADES DE UM TESTE DIAGNÓSTICO SENSIBILIDADE (S): É A CAPACIDADE DE UM TESTE DE DETECTAR OS POSITIVOS ENTRE OS DOENTES EXAMINADOS TESTES DE BAIXA SENSIBILIDADE RESULTAM EM MAIOR NÚMERO DE FALSOS NEGATIVOS.

Reatividade cruzada  Reatividade cruzada se refere à habilidade de um sítio de combinação de anticorpo em particular de reagir com mais de um determinante antigênico ou a habilidade de uma população de moléculas de anticorpos de reagir com mais de um antígeno. A Figura 5 ilustra como reações cruzadas podem ocorrer. Reações cruzadas aparecem porque o antígeno envolvido na reação cruzada compartilha um mesmo epitopo com o antígeno imunizador ou porque ele tem um epitopo que é estruturalmente semelhante ao epitopo no antígeno imunizante (multi-especificidade).

RESULTADOS DOS TESTES DIAGNÓSTICOS VERDADEIRO POSITIVO RESULTADO POSITIVO NA PRESENÇA DA DOENÇA FALSO POSITIVO RESULTADO POSITIVO NA AUSÊNCIA DA DOENÇA VERDADEIRO NEGATIVO RESULTADO NEGATIVO NA AUSÊNCIA DA DOENÇA FALSO NEGATIVO RESULTADO NEGATIVO NA PRESENÇA DA DOENÇA

IMPORTÂNCIA DOS TESTES SOROLÓGICOS NA PATOLOGIA CLÍNICA

Importância dos Testes Sorológicos na Patologia Clínica - Grande desenvolvimento dos testes sorológicos - Diagnóstico de certeza - Demonstração do patógeno - Identificação dos seus produtos nos tecidos ou fluidos do hospedeiro Problemas relacionados (encontrados)‏ - Nem sempre é possível - Ausência do agente - Falta de sensibilidade dos métodos empregados = direto ou indireto - Longos períodos de análises

Métodos imunológicos - São amplamente empregados - Suprem as falhas dos métodos parasitológicos ou microbiológicos - Pesquisam antígenos, anticorpos ou imunocomplexos - Rápidos, simples execução, possibilidade de automação, baixo custo operacional Aplicação dos Testes Sorológicos e Interpretação dos resultados - Auxilia os clínicos, patologistas - Orientação - Diagnóstico correto - Associar à investigações clínicas e epidemiológicas

Importância da Pesquisa de Anticorpos no Diagnóstico Individual (a) Elucidar processos patológicos com sintomas e sinais clínicos confundíveis – pesquisa de anticorpos específicos com testes padronizados Ex: toxoplasmose x mononucleose; toxoplasmose x rubéola (b) Diferenciar a fase da doença – detecção das diferentes classes de anticorpos, acompanhamento do surgimento das imunoglobulinas Ex: doenças congênitas (toxoxplasmose, sífilis)‏ (c) Diagnosticar doença congênita IgM – não atravessa a placenta x IgG – atravessa a placenta IgM – fase aguda da doença – pesquisa no sangue do cordão umbilical Acompanhamento do recém-nascido

(d) Selecionar doadores de sangue Triagem sorológico para a prevenção da doença transfusional – Chagas, HIV, HTLV I e II*, Sífilis, hepatites B e C Selecionar doadores e receptores de órgãos para transplantes (e) Pesquisa de anticorpos altamente específicos – antígenos do complexo principal de histocompatibilidade Tipagem dos antígenos de CPH (f) Avaliar o prognóstico da doença Pesquisa de anticorpos contra determinados componentes antigênicos – marcadores imunológicos para a avaliação do prognóstico de uma doença Ex: na hepatite B – pesquisa de antígeno HBeAg = componente de infectividade e a contagiosidade do vírus. * Os vírus T-linfotrópicos humanos, tipo 1 (HTLV-I) e tipo 2 (HTLV-II), foram os primeiros retrovírus humanos descobertos (1,2), pertencem à subfamília Oncornavirus dos Retrovirus e podem transformar linfócitos humanos que podem ser auto-sustentar "in vitro". Eles são distantemente relacionados aos vírus

(g) Avaliar a eficácia terapêutica e a suspensão da terapêutica Acompanhar a queda de anticorpos na circulação do paciente Eficácia e suspensão da terapêutica Ex: sífilis – acompanhar os títulos no teste de VDRL (h) Avaliar a imunidade específica naturalmente adquirida ou artificialmente induzida IgG – marcador de imunidade específica Anticorpos protetores Complexa constituição do patógeno Testes sensíveis (i) Verificar o agravamento da patologia Presença de auto-anticorpos, imunocomplexos

Importância da Pesquisa de Anticorpos em Inquéritos Soroepidemiológicos (a) Estabelecer prevalência da doença Pesquisa de anticorpos IgG x prevalência da doença (b) Verificar a erradicação da doença Investigação da presença da doença - erradicação da doença Ausência de anticorpos em crianças nascidas em local suspeito – erradicação (c) Verificar a reintrodução de novos casos em áreas consolidadas Presença de anticorpos IgM ou o aumento de anticorpos IgG – reintrodução do patógeno Monitoramento sorológico

Importância dos Testes Sorológicos na Pesquisa de Antígenos (a) Como critério de cura Ausência do patógeno ou de seus produtos após processo infeccioso (b) Definição da etiologia da doença Encontro do patógeno no hospedeiro define o processo infeccioso Emprego da PCR e métodos imunológicos (c) Na seleção de doadores de sangue Selecionar doadores de sangue pela pesquisa do agente etiológico Ex: hepatite B – pesquisa do HBsAg (d) Em inquéritos epidemiológicos Restrita Mapeamento das regiões

Variações Resposta imune do hospedeiro: falso positivo (reações cruzadas), falso negativo Todos os fatores devem ser analisados para definir o quadro patológico mais próximo possível do estado clínico do paciente Importancia da triagem e Entrevista