MANIPULAÇÃO DO DNA in vitro: DNA- recombinante e PCR
CLIVAGEM DO DNA EM FRAGMENTOS ENDONUCLEASES DE RESTRIÇÃO Análise Molecular do DNA – somente possível fragmentando o DNA em pequenos tamanhos: através de endonucleases de restrição (enzimas bacterianas que clivam internamente o DNA) ENDONUCLEASES DE RESTRIÇÃO Tipo de nuclease que cliva uma cadeia dupla de DNA sempre que identificar uma sequência específica de 4 a 8 pares de bases, produzindo um grupo 3’- OH em uma extremidade e um grupo 5’- fosfato na outra. As sequências reconhecidas apresentam nas duas cadeias complementares sequências idênticas mas invertidas: PALÍNDROMO.
CLIVAGEM DO DNA EM FRAGMENTOS NOMENCLATURA DAS ENDONUCLEASES DE RESTRIÇÃO Denominação de acordo com o organismo da qual foi isolada. Primeira letra corresponde ao gênero do microrganismo. As duas letras seguintes referem-se a espécie e um número final indica a ordem da descoberta da enzima no organismo. Ex:. Hae III (3º ER isolada da bactéria Haemofilus aegyptius)
CLIVAGEM DO DNA EM FRAGMENTOS
CLIVAGEM DO DNA EM FRAGMENTOS DNA LIGASE Enzima que promove a ligação dos fragmentos de DNA em vetores previamente clivados por endonucleases de restrição. O DNA ligase requer um grupo OH livre na extremidade 3' de uma das cadeias de DNA e um grupo fosfato na extremidade 5' da outra cadeia.
REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE (PCR) HISTÓRIA Ferramenta que permite amplificar uma seqüência específica de DNA (seq. alvo) em milhões de vezes dentro de poucas horas (Xerox) PCR citada em mais de 200.000 trabalhos científicos (08/2005)
REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE (PCR)
1c 1a 2c 2a 3c 3a 4c 4a 5c 5a 6c 6a P P = padrão de tamanho molecular lambda Hind III Nc = controle sem DNA molde Ne = amostra com DNA molde – sem resultado positivo (molde?) Gel será refeito utilizando-se outros PCRs Bandas visíveis [Gel de agarose 1% corado com brometo de etídio e fotografado sob luz UV] PCR
CROMATOGRAFIA POR SOUTHERN BLOT 2. HIBRIDIZAÇÃO DA SONDA A FRAGMENTOS DE DNA
ANÁLISE DE POLIMORFISMOS DE DNA (RFLP)