EXPERIÊNCIA DA FUNDAÇÃO PRÓ-SANGUE COM O TESTE NAT José Eduardo Levi Depto. De Biologia Molecular Fundação Pró-Sangue/Hemocentro de São Paulo 07/06/2013

Porcentagem de Descarte Sorológico na FPS/HSP 1991Int.: ALT, HCV, HTLV; 1992 Int. ELISA Sífilis; 1993 Ret. Fix Complemento; 1994 Int. HBc e Informatica; 2001 Ret. HA Chagas; 2003 Ret. VDRL; 2004 Ret. ALT e IFI Chagas; Int. HIV Combo; 2008 Int. HCV Combo; 2011 Int. NAT HIV/HCV

Porcentagem de Descarte - HIV Teste em uso e critério: ELISA – Ag + Ac – Biorad (± 10%) CMIA - Ag + Ac – Architect Abbott ( - 10%) Obs.: 2004 ELISA Ag + Ac 2011 NAT

Porcentagem de Descarte - HCV Teste em uso e critério: ELISA – Ag + Ac – Biorad (± 10%) Obs.: 2008 ELISA Ag + Ac 2011 NAT

FPS 2010 ANTI-HCV= 0.32% ANTI-HIV= 0.18%

Marcadores sorológicos e moleculares na infecção recente pelo HIV-1 RNA plasmático DT = 21.5 hrs Anticorpos anti-HIV 1nd gen 2nd gen Antígeno p24 3rd gen “blip” viremia 11 16 22 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Infectividade teórica Dia 0 RNA viral Dia 11 Antígeno p24 Dia 16 Anticorpos anti-HIV Dia 22

11.3/MILHÃO = 1:88.500

“Eu penso que doar sangue é uma maneira boa, rápida e anônima de ter um teste de sangue” “Eu doo sangue para ter meus resultados” Entre 3061 participantes, 208 (7%) se encixaram na definição de “buscadores de teste”!

Marcadores sorológicos e moleculares na infecção recente pelo HIV-1 RNA plasmático DT = 21.5 hrs Anticorpos anti-HIV 1nd gen 2nd gen Antígeno p24 3rd gen “blip” viremia 11 16 22 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Infectividade teórica Dia 0 RNA viral Dia 11 Antígeno p24 Dia 16 Anticorpos anti-HIV Dia 22

Teste de Ácido Nucléico (NAT) Portarias do Brasil Port. 262 M.S. 02/2002 - introdução do NAT em 6 meses: 1 laboratório por estado “pool” de 8 amostras Port. 1407 M.S. 08/2002 – adiada por 6 meses: Alto custo do teste. Incapacidade de organizar todos laboratórios Port. 79 01/2003 - adiada por 1 ano Port. 112 01/2004 - Dispõe sobre a implantação, no âmbito da Hemorrede Nacional, da realização dos testes de amplificação e detecção de ácidos nucléicos (NAT), para HIV e HCV. Art. 1º Determinar a implantação, em etapas, no âmbito da Hemorrede Nacional, da realização dos testes de amplificação e de detecção de ácidos nucléicos (NAT), para HIV e para HCV, nas amostras de sangue de doadores.

Plataforma de testes NAT Bio-Manguinhos Plataforma multiplex para HCV e HIV; Pool de 6 amostras; 2008 - estudos-piloto - SC 2010 - Estudos multicêntricos (outros hemocentros brasileiros: SC, PE, RJ e SP) para aprovação, validação e logística. Registro em 12/2010 01/05/2011 – Início oficial nos hemocentros de SC, PE, RJ e SP 14 Sítio Testadores (tds iniciaram falta BA). 17

blood units/day (based on the # of serology tests) 30 ¬ 100 100 ¬ 200 200 ¬ 400 400 ¬ 800 800 ¬ 1000 1000 ¬ 1500 1500 ¬ 2000  Belém, 349  Manaus, 376 Fortaleza, 646   Recife, 942  Salvador, 438 Brasília, 773   B.Horizonte,  1192 Campo Grande, 629  São Paulo 1923   Rio de Janeiro, 1083 Curitiba, 769  Florianópolis, 1115 BUT … São Paulo State – due to size and complexity … will be addressed further ! How to? Choice of Blood Center Labs where NAT will be installed – Centralized system based on: Easiness for primary tube logistics and report return within platelet saving time (<24h) Throughput capacity and infra-structure of labs from Main Blood Centers within each micro-region already established for serology tests.

Manual Operacional NAT Sítio Testador (SIT) 24 horas para resultado após o recebimento Encaminhar tubo para coleta Relatórios CGSH e Bio-Manguinhos Unidade Referenciadora de Amostra (URA) - encaminhar amostra, soroteca e da sorologia Relatório para o SIT Distribuição dos tubos para UCA Coleta e centrifuga amostra Conservar em geladeira Unidade Coletora de Amostra (UCA) Relatório para a URA

Plataforma de testes NAT Bio-Manguinhos Extração – 2h e 30min Pooling – 2h 30 min - 20ºC 30 min + 22ºC Amplificação–3h PCR Setup –30min Tempo total 9h

NAT – Bio-Manguinhos - Etapas do teste Tubo primário - PPT Pool – 6 amostras Plataforma automática Janus Perkin Elmer

Protocolo de rotina TOTAL POOL SINGLE 1 552 2 522 516 6 3 492 480 12 4 2 522 516 6 3 492 480 12 4 462 444 18 5 432 408 24 402 372 30 7 336 36 8 342 300 42 9 312 264 48 10 92

NAT – Bio-Manguinhos - Etapas do teste Adição da partícula calibradora Extração – Biorobô MDx (T. lise e protease, temp 65ºC) Amplificação + Detecção (HIV, HCV part calibradora) – PCR tempo real Applied Biosystems 7300

NAT FPS Total 532.700 doações

Amostra Janela HIV – Retrovigilância (Soroteca) - Processada dia 17 de março de 2011 Amostra em SINGLE Ct: 32,54

Total de doações = 379.422 (FPS+HS) HCV Maio de 2011 a Abril de 2013 Total de doações = 379.422 (FPS+HS) Total de resultados reagentes: 1052 Prevalência = 0.05% EIA Ac/Ag Reagente Não Reagente NAT Detectável 192 7 (falso positivos NAT) NAT Não Detectável 853 378.370 Negativo

Total de doações = 379.422 (FPS+HS) HIV Maio de 2011 a Abril de 2013 Total de doações = 379.422 (FPS+HS) Total de resultados reagentes 1065 Prevalência = 0.04% Ac/Ag 2 testes EIA + CMIA Reagente Não Reagente NAT Detectável 163 28 (falso positivo NAT) 1 janela em abril de 2013 NAT Não Detectável 1065 378.357

HIV 28 amostras não são Janela Imunológica – falso positivo do NAT PF coleta amostra bolsa CT retorno EIA WB NAT 3804045 03/12/2010 04800001938-8 104109940 54 11/01/2011 N NR   11/02/2011 194828 09/12/2010 0210265394-3 104164080 56 2903482 11/12/2010 02102651648-0 104164325 44 31/12/2010 05/02/2011 2986278 13/12/2010 0502215483-8 104115054 58 24/02/2011 2774240 15/12/2010 0502215520-6 104169001 45 22/12/2010 3779751 0502219335-3 104166036 16 01/03/2011 495641 0502223922-1 104166736 48 13/12/2011 3808786 21/12/2010 0502225709-2 104144193 3811196 0502218389-7 104175431 3703095 02/01/2011 0502218572-5 104175181 04/02/2012 2570093 13/01/2011 0502230082-6 104177712 57 15/02/2011 3674534 14/01/2011 0502229960-7 104177611 15 3816361 19/01/2011 0502229400-1 104182658 35 1508395 24/01/2011 0502228984-9 104177257 15/03/2011 3817893 4800002559-0 104147730 46 02/03/2012 2978849 26/01/2011 0502232590-0 104179994 51 02/03/2011 3573837 28/01/2011 0700365782-1 104185355 23/02/2011 18/04/2011 3395295 21/02/2011 0502240019-7 104203382 59 24/03/2011 15/04/201 3759227 20/03/2011 0502247606-1 104221526 2736457 0502242568-8 104221370 49 13/04/2011 06/05/2011 3764909 09/04/2011 0502247152-3 104229396 24/41/ND 09/05/2011 2147942 22/06/2011 4800005590-2 104236830 17/53/ND 27/07/2011 1754169 04/07/2011 0502275726-5 104248542 16/11/2011 3628109 07/07/2011 0502276968-9 104229877 50/52/ND 10/08/2011 1909304 11/07/2011 0700367705-9 104269449 51/54/ND 2100337 20/07/2011 4800006494-4 104237406 47/55/ND 31/08/2011 3886339 17/09/2011 0502297325-1 104334478 59/50/ND 19/10/2011 2026869 29/09/2011 0210295405-6 104333646 57/47/ND 21/10/2011 118057 30/09/2011 0502308004-8 104327583 53/59/ND 08/02/2012

Última Doação Negativa: 02/08/2011 matriz capsídeo gp41 gp120 envelope CD4 CCR5 CXCR4 transcriptase reversa RNA viral SOROCONVERSÃO - HIV Doador: esporádico – 11 doações na FPS/HSP Última Doação Negativa: 02/08/2011 Sexo: masculino Idade: 36 anos gp120 gp160 p17 p24 Banda controle 16/04/13 03/05/13 14/05/13 Quimio (S/CO) NR 571,990 8,470 ELISA (DO) 3,000 2,784 NAT (CT) 32,0 17,856 22,848 W. BLOT - IND POS Teste de Western Blot: MP Diagnostics: HIV BLOT 2.2 Testes : Abbott: HIV Ag/Ac COMBO Quimioluminescencia BioRad: Genscreen “ULTRA HIV Ag-Ab (ELISA)”

Teste NAT - 17/04/2013 Pool de 6 amostras - CT: 34,6374

Teste NAT - 18/04/2013 Amostra única - CT: 32,8703

Teste NAT - 03/05/2013 Amostra única – CT: 17,856

Teste NAT - 17/05/2013 Amostra única – CT: 22,848

RENDIMENTO PROJETADO PARA HIV WP NAT – MP NA FPS = 4.2/MILHÃO = 1:238.000 OBSERVADO = 1: 328.000

RENDIMENTO NAT NO BRASIL N AMOSTRAS CASOS WP TAXA HCV 1.085.548 4 1:271.387 HIV 1.024.755 5 1:204.951 LEVI ET AL., HEMO 2011

RISCO HIV –TX PRÉ-NAT MP NA FPS = 1:88.500 RISCO HIV –TX PÓS-NAT MP NA FPS = 1:156.000

HIV transfusion transmission despite NAT testing Nanci Salles, José E HIV transfusion transmission despite NAT testing Nanci Salles, José E. Levi, Cláudia C. Barreto, Camila M. Romano, Luciana Sampaio, Ester C. Sabino and Alfredo Mendrone Jr. Transfusion, 2013, in press Receptor – Em Novembro 2011 apresentou sorologia e NAT + para HIV Em Julho 2011 a sorologia anti-HIV era negativa. Entre Agosto e Novembro Recebeu 47 transfusões com unidades da FPS. Todas as doações correspondentes foram re-testadas com NAT individual, sendo todas negativas. Os doadores foram reconvocados, 37 compareceram. Um doador apresentou soroconversão para HIV e NAT+.

HIV transfusion transmission despite NAT testing Nanci Salles, José E HIV transfusion transmission despite NAT testing Nanci Salles, José E. Levi, Cláudia C. Barreto, Camila M. Romano, Luciana Sampaio, Ester C. Sabino and Alfredo Mendrone Jr. Transfusion, 2013, in press Doador, Homem, 22 anos, 3ª doação espontânea na FPS DATA ANTI-HIV NAT CARGA VIRAL 28/09/2012 NEG INDETECTÁVEL 17/12/2012 POS 39,658 cps/mL

HIV transfusion transmission despite NAT testing Nanci Salles, José E HIV transfusion transmission despite NAT testing Nanci Salles, José E. Levi, Cláudia C. Barreto, Camola M. Romano, Luciana Sampaio, Ester C. Sabino and Alfredo Mendrone Jr.Transfusion, 2013, in press Número de réplicas Cobas MPX N+ Procleix Bio-Manguinhos Pura 20 3 13 Diluida 1:6 5 1 Plasma Negativo CARGA VIRAL ESTIMADA POR PROBIT ANALYSIS Entre 3.7 – 7.5 UI/mL

Marcadores sorológicos e moleculares na infecção recente pelo HIV-1 RNA plasmático DT = 21.5 hrs Anticorpos anti-HIV “blip” viremia 1nd gen 2nd gen Infecção Antígeno p24 3rd gen 11 16 22 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Infectividade teórica Dia 0 RNA viral Dia 11 Antígeno p24 Dia 16 Anticorpos anti-HIV Dia 22

jelevi@prosangue.sp.gov.br