ENSAIOS DE POTÊNCIA – MÉTODOS INSTRUMENTAIS ANÁLISE FARMACOPÊICA ENSAIOS DE POTÊNCIA – MÉTODOS INSTRUMENTAIS

Métodos Quantitativos Instrumentais Métodos Espectrométricos São mais sensíveis; Requerem quantidades menores de amostras; São mais seletivos que os métodos clássicos (análise volumétrica). Métodos Espectrométricos - São caracterizados pela interação entre a matéria e a energia eletromagnética. Energia Radiante: dividida em várias regiões e relaciona-se com os mecanismos de transições atômicas ou moleculares pertinentes a cada região.

MÉTODOS ESPECTROMÉTRICOS Região do espectro Λ (comprimento de onda) Modificações Interação energia / matéria Raios gama 0,0001 – 0,01 nm Reações nucleares Raios x 0,01 – 2 nm Transições de elétrons de camada K e L Ultravioleta afastado 2 – 200 nm Transições de elétrons de camada intermediária Ultravioleta 200 – 400 nm Transições de elétrons valência (externos) Visível 400 – 750 nm Infravermelho próximo 0,75 – 2,5 µm Vibrações moleculares Infravermelho 2,5 – 25 µm Rotações moleculares e vibrações fracas Microondas 1 mm – 30 cm Rotações moleculares

ESPECTROSCOPIA DE ABSORÇÃO NO UV-VISÍVEL Conceito: técnica analítica quali-quantitativa que tem como fundamento a interação da radiação eletromagnética com diferentes espécies químicas: moléculas, íons, átomos isolados. Absorção: processo específico relacionado com a estrutura da espécie absorvente. Análise farmacopeica: Ultravioleta: (λ 190 – 380 nm) Visível: (λ 380 – 780 nm)

ESPECTROSCOPIA DE ABSORÇÃO NO UV-VIS Objetivo: avaliação da qualidade de medicamentos, alimentos, cosméticos, insumos, análises clínicas e toxicológicas: IDENTIFICAÇÃO E QUANTIFICAÇÃO. Características: facilidade de manuseio e operação, boa sensibilidade, boa exatidão, ampla aplicabilidade, porém pouca seletividade.

LEI DE LAMBERT-BEER Io > It Correlaciona a intensidade de energia absorvida com a concentração da solução. Io It b “A quantidade de luz que é absorvida por uma solução depende da concentração da substância absorvente e da espessura da solução através da qual a luz passa”. Io > It c= concentração da espécie química absorvente (solução em análise) b= espessura atravessada pelo feixe luminoso Io = intensidade de luz incidente It = intensidade de luz transmitida ε = cte característica para cada solução. Log I0 = ε . c . It It A = ε . c . It

Desvios da Lei de Lambert-Beer Presença de mais de uma substância absorvente; Mudança de natureza do solvente ou soluções muito concentradas; Incidência de luz com mais de um comprimento de onda em virtude de uma larga faixa de luz. Ps. Espectrofotômetros de boa qualidade apresentam menor desvio porque fornecem faixas de luz estreitas e um mínimo de luz dispersa.

Definições: - Deslocamento batocrômico: deslocamento da absorção para comprimento de onda maior devido efeitos de substituição do solvente (deslocamento para o vermelho). Deslocamento hipsocrômico: deslocamento da absorção para comprimento de onda menor devido efeitos de substituição do solvente (deslocamento para o azul). Efeito hipercrômico: é o aumento da intensidade de absorção. Efeito hipocrômico: é uma diminuição da intensidade de absorção.

Comprimento de onda (nm) Espectroscopia no UV-Vis Para quantificar substâncias que não absorvem a luz a nenhum comprimento de onda da região do UV ou compostos coloridos, as leituras devem ser efetuadas na região do visível (Vis) - λ 380 – 780 nm. Ou realizar reação da substância com reagente específico, de modo a desenvolver cor cuja intensidade é diretamente proporcional à concentração. Cor Comprimento de onda (nm) Violeta 390 – 455 Azul 455 – 492 Verde 492 – 577 Amarelo 577 – 597 Laranja 597 – 622 vermelho 622 - 780 Região do visível

ESPECTROFOTÔMETROS Instrumento usado para medir absorbância da solução em um ou mais comprimentos de onda. Quando se mede a absorção para fins de quantificação, o comprimento de onda escolhido, é aquele em que se observa absorção máxima. A curva de absorção espectral é a representação gráfica da absorbância em relação ao comprimento de onda.

Fonte luminosa: Região do UV: lâmpada de descarga de hidrogênio ou de deutério (190 – 370 nm). Região do Visível: lâmpada de filamento de tungstênio (350 – 750 nm) Monocromador: seleciona comprimento de onda da fonte luminosa. Detector: desenvolve corrente elétrica. Amplificador: amplia o sinal. Galvanômetro: mede a intensidade de luz. Cubeta: local onde é transferida a amostra ou solução. Pode ser de vidro, quartzo ou sílica transparente, com faces perfeitamente paralelas, espessura de 1cm (padrão).

Variações nos cálculos de doseamento Absortividade (ε): razão entre absorbância (A) e o produto da concentração (c) em g/L e caminho óptico (b) em cm. ε = A/bc ou A = ε . b .c - Absortividade Molar (E) = razão entre absorbância (A) e o produto da concentração (c) em mol/L e caminho óptico (b) em cm. E = A/bc ou E = ε . PM

Aplicações da fotometria (Exemplo prático) Dosagem de Proteína A principal finalidade de uma medida espectrofotométrica, nas regiões do ultravioleta e visível, é avaliar quantidades. Assim, é extremamente importante efetuar uma rigorosa calibração visando obter resultados exatos. Para obter-se uma curva de calibração alguns aspectos devem ser considerados como: A escolha de uma solução padrão ( Ex:proteina-Albumina) O estabelecimento de um branco adequado A seleção da área espectral.

Preparo de uma curva padrão (ou calibração) O preparo da curva de calibração é de grande importância e deve ser bem entendido. Todo analista deve ser capaz de preparar suas próprias curvas de calibração e interpretar os resultados obtidos. Para se obter o valor da concentração de substâncias cuja concentração se desconhece, é necessário estabelecer uma relação entre a absorbância desta solução em diferentes concentrações com as suas concentrações. Isto se chama curva de calibração (curva padrão).

Curva de Calibração - Preparar a série de padrões de concentração conhecida, cobrindo-se a faixa de leitura. Espectro de absorção do permanganato de potássio A amostra (1) tem 66 mg/L de concentração. As demais (2),(3),(4) e (5) foram diluídas para (0,8), (0,6), (0,4) e (0,2) da concentração da primeira amostra, respectivamente.

Preparar uma série de padrões exatos, cobrindo a faixa de trabalho usada ou indicada. Usar o padrão recomendado para o método a ser calibrado. 2. Dosar todos os padrões de acordo com a técnica recomendada. Efetuar as leituras colorimétricas, usando o branco apropriado para acertar o zero-A, além do comprimento de onda recomendado pela literatura ou obtido pela curva de absorção espectral previamente realizada. 3. Obter os valores de Absorbância. 4. Plotar os resultados em papel milimetrado, relacionando Absorbância (ordenada) com as concentrações dos padrões (abcissa). Examinar bem os pontos e decidir se eles serão cobertos por uma linha reta. Se os pontos aparentemente seguirem uma linha reta, traçar uma curva de modo que mais se aproxime de todos os pontos obtidos. A curva não deve ser traçada de ponto a ponto, mas interpolando através dos pontos. 5. Examinar a curva traçada, avaliando se ela tem sensibilidade correta

Temos que preparar as diluições do padrão 10 mg/ml tendo como volume final 1,0 ml. Recorremos a regra geral da diluição: Ci · Vi = Cf · Vf onde: Ci = concentração inicial (10 mg/ml) Vi = volume a ser retirado do padrão (?) Cf = concentração final (2mg/ml) Vf = volume final (1,0 ml) Albumina 10 mg/ml 2 mg/ml Exemplo: Tubo 1 ( 2,0 mg/ml ) 10 mg/ml · Vi (?) = 2 mg/ml · 1,0 mg/ml Vi = 0,2 ml Vi = 0,2 ml do padrão + 0,8 ml de água 1,0 ml (2 mg/ml)

Na prática, como será a performance de vocês? Curva padrão de Albumina Tubo Conc. (mg/ml) Albumina 10 mg/ml (ml) Água (ml) Biureto (ml) A 1 2,0 4,0 2 3 6,0 4 8,0 5 10,0 BR ----- 1,0

Preenchendo a tabela para obter a curva... Tubo Conc. (mg/ml) Albumina 10 mg/ml (ml) Água (ml) Biureto (ml) A 1 2,0 4,0 2 3 6,0 4 8,0 5 10,0 BR ----- 1,0 0,2 0,8 0,4 0,6 0,6 0,4 0,8 0,2 1,0 --- Deixar os tubos em repouso por 10 minutos. Ler as absorbâncias de todos os tubos contra o Branco no  adequado. Traçar o gráfico e analisar.

Uma boa curva padrão A curva padrão ideal deve ter ângulo aproximado de 45° 2 4 6 8 10 mg/ml 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 A C Equação da reta: y = bx + a

4,0 ml do reagente de biureto Dosagem de proteínas totais de uma amostra 1,0 ml da amostra 4,0 ml do reagente de biureto Esperar 10 minutos Ler contra o Branco Amostra Conc. ? Determinar a concentração de proteínas totais na amostra recorrendo à curva padrão 2 4 6 8 10 mg/ml 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 A C

Exemplo pela extrapolação gráfica e pelo cálculo da equação da reta: Curva de calibração da albumina Equação da reta: y = bx + a 2 4 6 8 10 mg/ml 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 A C Leitura da amostra Y = 0,0579x + 0,001 0,438 = 0,0579x + 0,001 X = 7,56 mg/mL [ ] ? 7,56 mg/mL

O uso de Fator de Calibração (FC) É um artifício usado rotineiramente e seu cálculo é feito como: concentração padrão FC =  absorbância padrão Finalmente, para calcular a concentração da amostra: [amostra] = Absorbância da amostra · FC