Imunohistoquimica Microscopia de Fluorescência Prof.Doutor José Cabeda

Processamento de amostras Amostras fixadas Fixação Parafinação Armazenamento RT Preparar lâmina (silano, etc) Cortar 4-6mm Retirar parafina Rehidratar Recuperar Ag marcar Amostras Congeladas Retirar gordura e tecido conectivo 1.5 cm2 x 0.5 cm Transportar em MEM/RPMI 4ºC Embeber (até 1 h pós colheita) Armazenar –70ºC Preparar Lâmina Cortar 4-5mm Fixar com paraformaldeido a 1% marcar Prof. Doutor José Cabeda

Prof. Doutor José Cabeda Corte de tecidos Prof. Doutor José Cabeda

Prof. Doutor José Cabeda Fixação Formaldeído Método de eleição Mecanismo preciso desconhecido, mas envolve “crosslinking” Utiliza-se habitualmente Formaldeído 3.7% pH neutro Responsável por “epitope masking” Amostras com cerca de 1.0 x 1.0 x 0.3 cm colocadas numa cassete e imersas em 20 volumes de fixador por 12 a 24 h Transferir para Et-oh 70% até processar Alcool Muito menos utilizado Prof. Doutor José Cabeda

Prof. Doutor José Cabeda Congelação Remover excesso de MEM/RPMI tocando em papel Embeber em O.C.T. em molde Congelar durante 20 a 30 segundos em banho de isopentano arrefecido com Azoto liquido (-135 a -140ºC) Gelo seco (-30ºC) Banho de congelação de tecidos (-52ºC) Remover excesso de O.C.T. Com bisturi Congelar a –70ºC / -80ºC Prof. Doutor José Cabeda

Recuperação de Antigénios Aumenta a sensibilidade da imunohistoquimica Reverte parcialmente o mascarar de Ag devido à fixação Mecanismo preciso não é conhecido mas envolve a quebra de “crosslinks” entre proteínas envolvendo ou não Ca2+ Envolve habitualmente a utilização de calor(100ºC) durante 20 min. Soluções: 10 mM Tampão citrato pH 3 a 6 100 mM Tris-Cl pH 8 a 10 com/sem ureia 1 mM EDTA pH 8.0 Eficiente p/ nucleo Causa background por recuperação biotina endógena Prof. Doutor José Cabeda

Prof. Doutor José Cabeda Tecidos control Não existem tecidos standard para control Tecidos control devem ser processados da mesma forma que os tecidos teste Em aparelhos automáticos, os tecidos control devem estar na mesma lâmina que o teste Prof. Doutor José Cabeda

Optimização da marcação Diluição do anticorpo primário  []  sensibilidade mas tb R.inespecíficas Tempo de marcação do primário Tipo e concentração do secundário Tampão de recuperação de Ag Utilização de EDTA Melhora marcação com alguns Ag força um passo de bloqueio de biotina endógena Temperatura de incubação Utilização de sistemas automáticos limita a escolha Gama de temperaturas limitada Anticorpos secundários e reagentes de detecção optimizados Tempos de incubação devem ser compatíveis entre os vários protocolos Prof. Doutor José Cabeda

Sistemas de detecção (I) Maioritáriamente baseados em “horseradish peroxidase” (preferida nos marcadores automáticos) Fosfatase alcalina 3 passos PAP (peroxidade anti-peroxidase) LSAB (enzyme labelled streptavidin biotin) ABC (Avidin biotin complex) Prof. Doutor José Cabeda

Sistemas de detecção (II) 2 passos Menos sensíveis Recentemente introduzidos os polímeros de dextran com cerca de 100 moléculas de enzima sensibilidade semelhante aos métodos com 3 passos não envolve biotina, pelo que não exige o bloqueio da biotina endógena Prof. Doutor José Cabeda

Sistemas de detecção (III) 5 passos (Extremamente sensíveis, mas inespecificidade pode ser problemática) primário; sec.-biotina; ABC-peroxidase;biotinil-tiramida+H2O2; Peroxidase+H2O2 geram radicais livres que activam a biotinil-tiramida, a qual se liga então covalentemente a grupos amino disponíveis na vizinhança, gerando um tapete de biotina Peroxidase-estreptavidina A estreptavidina liga-se ao “tapete” de biotina na vizinhança do anticorpo, revestindo-o com peroxidase Cromogénio Prof. Doutor José Cabeda

Sistemas de detecção (IV) Cromogénio Peroxidase 3,3’-Diaminobenzidina (DAB) –castanho 3-amino-9-etilcarbazol (AEC) – vermelho Fosfatase alcalina 5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfato nitrobluo (BCIP/NBT) – purpura Fast-red-naphtol (AS-TR) – vermelho Escolha depende de Contrastante (hematoxilina ou verde de metilo) Tempo de incubação (DAB mais rápido que AST-TR) Segurança (DAB é carcinogénio) Duração (DAB origina marcação permanente) Contraste (AEC origina um excelente contraste) Prof. Doutor José Cabeda

Sistemas de detecção (V) Prof. Doutor José Cabeda

Imunohistoquímica -Utilidade Prof. Doutor José Cabeda

Imunofluorescência (I) Prof. Doutor José Cabeda

Imunofluorescência (II) IgM IgG IgG IgG IgA Prof. Doutor José Cabeda