Casos Clínicos Dr. Rodrigo Elisandro Mendes Pós-doutorando da Disciplina de Infectologia Universidade Federal de São Paulo - EPM Dra. Eliete A. M. Frigatto Laboratório Central - Hospital São Paulo UNIFESP - EPM

Caso 1 Paciente de 49 anos internou com quadro febril em 25/03/05 apresentando infecção em lobo inferior esquerdo. Sendo isolado em hemocultura um BGN e posteriormente identificado como Enterobacter aerogenes. Antibiograma: Cefalotina: 256 µg/ml Cefoxitina: 256 µg/ml Cefotaxima: 32 µg/ml Ceftazidima: 256 µg/ml Cefepima: 2 µg/ml Imipenem: 0,5 µg/ml Piperacilina/Tazobactam: 4 µg/ml Amicacina: 256 µg/ml Gatifloxacina: 1 µg/ml Paciente tratado com cefepima sem melhora. No quinto dia após o início do tratamento foi colhido nova hemocultura com crescimento de Enterobacter aerogenes. Antibiograma: Cefalotina: 256 µg/ml Cefoxitina: 256 µg/ml Cefotaxima: 64 µg/ml Ceftazidima: 256 µg/ml Cefepima: 4 µg/ml Imipenem: 0,5 µg/ml Piperacilina/Tazobactam: 2 µg/ml Amicacina: 256 µg/ml Gatifloxacina: 0,5 µg/ml

Teste de disco-aproximação Caso 1 Teste de disco-aproximação

Teste de discos combinados Caso 1 Teste de discos combinados

Caso 1 Etest

Caracterização dos mecanismos de resistência à cefepima e ertapenem em Enterobacter spp. isolados de infecções de corrente sanguínea de pacientes internados no Hospital São Paulo

Enterobacter aerogenes 93 AMOSTRAS DE Enterobacter spp. Enterobacter cloacae 7 AMOSTRAS DE Enterobacter aerogenes 93 AMOSTRAS DE Enterobacter spp. 14 Amostras (15%) apresentaram sensibilidade reduzida ou resistência à cefepima UMA AMOSTRA DE Enterobacter hormaechei UMA AMOSTRA DE Enterobacter amnigenus

Tabela 1. Perfil de sensibilidade e tipagem molecular das amostras de Enterobacter spp. não-sensíveis à cefepima avaliadas. Cefotaxime Ceftazidime Cefepime Imipenem Meropenem Ertapenem Pip/ Taz * Gatifloxacin 1 10.831 E. cloacae > 256 64 0.5 £ 0.25 4 8 222 - 150 S 2 10.480 32 3 13.501 13.550 5 14.008 6 11.334 7 12.035 10.833 9 11.235 10 10.739 E. aerogenes 153 11 13.125 0.06 12 10.922 13 11.247 16 14 20.096 Ribotype Strain # MICs µ g/mL Specie *- Pip/Taz – Piperacillin/Tazobactam

Tabela 2. ß-lactamases encontradas nas amostras de Enterobacter spp Tabela 2. ß-lactamases encontradas nas amostras de Enterobacter spp. não-sensíveis à cefepima avaliadas. CIMs AmpC FEP Etest ® Teste de Hidrólise SYN 2190 10.831 > 256 Negativo Positivo ESBL 10.480 13.501 13.550 14.008 11.334 12.035 10.833 11.235 10.739 32 13.125 10.922 11.247 16 20.096 Amostra Resultado

256 ESBL 32-256 16 AmpC 36 KDa 35 KDa Figura 1. Perfil de proteínas de membrana externa das amostras de Enterobacter spp. não-sensíveis à cefepima avaliadas.

Caso 2 Paciente 6 anos, do sexo feminino, com diagnóstico de leucemia linfoblástica aguda em 1996. 06/01/99 - Sépsis - Hemocultura: Klebsiella oxytoca (cefepime e tobramicina por 3 semanas); 22/2/99 - Após QT a paciente volta a ficar séptica e novamente é isolado em hemocultura K. oxytoca (resistente a cefepime).

Pergunta!!! Caso 2 A paciente adquiriu uma nova infecção por K. oxytoca? A paciente está tendo uma recaída?

Caso 2  1 2 PFGE: SpeI 37C - NEB2*, 5”- 60”, 6 V/cm, 23 horas.

Perfil de proteína de membrana externa (OMP) Caso 2 Perfil de proteína de membrana externa (OMP) Gel de poliacrilamida 10%

Enterobacter spp. com diminuição de sensibilidade a ertapenem Caso 5 Enterobacter spp. com diminuição de sensibilidade a ertapenem Durante fevereiro de 2005 foram isolados 14 Enterobacter spp. de pacientes em serviço de diálise no Hospital do Rim – UNIFESP – EPM; As amostras bacterianas apresentaram MICs para ertapenem entre 4 e 16 µg/ml e MICs < 0,12 µg/ml para imipenem e meropenem; Oito amostras isoladas durante o período foram melhor caracterizadas;

Enterobacter spp. com diminuição de sensibilidade a ertapenem Caso 5 Enterobacter spp. com diminuição de sensibilidade a ertapenem Entre as 8 amostras avaliadas, 7 apresentaram o mesmo ribogrupo (222-150-S-1); Testes de diluição em ágar com e sem inibidor de AmpC (SYN 2190) não demonstraram diferenças de MICs para nenhum dos carbapenems testados; Testes de diluição em ágar com e sem inibidor de bomba de efluxo (reserpina) não demonstraram diferenças de MICs para nenhum dos carbapenems testados;

Enterobacter spp. com diminuição de sensibilidade a ertapenem Caso 5 Enterobacter spp. com diminuição de sensibilidade a ertapenem Teste para avaliação de ponto isoelétrico (pI) identificou uma forte banda com pI 8.0; 1 2 3 4 C-

Enterobacter spp. com diminuição de sensibilidade a ertapenem Caso 5 Enterobacter spp. com diminuição de sensibilidade a ertapenem Avaliação do perfil de proteínas de membrana externa (OMP) demonstrou a diminuição da expressão de duas OMPs de aproximadamente 49 e 54 kDa;  C C 1 2 3 4 54 kDa 49 kDa

1 2 3 4 5 L 1 2 3 4 5

Comparação das atividades antimicrobianas de ertapenem e imipenem contra enterobactérias: O laboratório de microbiologia deve rotineiramente testar imipenem e ertapenem? 2307 amostras de Enterobacteriaceae foram avaliadas. Os resultados de CIMs entre ertapenem e imipenem foram concordantes em 98,4% (2270/2307) das amostras. Apenas 1,6% (37/2307) das amostras avaliadas apresentaram resultados de categorias de sensibilidade entre ertapenem e imipenem discordantes 0,9% (21/2307) erros leves e 0,7% (16/2307) erros muito graves). Estas discordâncias foram observadas em K. pneumoniae produtora de ESBL (05 erros leves e 13 erros muito graves), Serratia spp. (01 erro leve) e em amostras de Enterobacter spp. hiperprodutoras de AmpC (15 erros leves e 03 erro muito grave).

Comparação das atividades antimicrobianas de ertapenem e imipenem contra enterobactérias: O laboratório de microbiologia deve rotineiramente testar imipenem e ertapenem? SENTRY Antimicrobial Surveillance Program. Janeiro de 2003 a dezembro de 2004.

Seleção in vivo de mutante com ausência de expressão de proteínas de membrana externa (OMPs) Paciente do sexo masculino, de 55 anos, submetido a transplante hepático no ano de 2005; Durante pós-operatório evoluiu com quadro sugestivo de Síndrome do Desconforto Respiratório Agudo; Pneumonia(?) – Terapia antimicrobiana com cefepime e clindamicina; Devido à ausência de melhora clínica e radiológica do infiltrado pulmonar – novo esquema – meropenem, teicoplanina e fluconazol; LBA (27/04/2005) – crescimento de K. pneumoniae (Amostra 1); Piora clínica – novo LBA (23/05/2005), crescimento de K. pneumoniae resistente à imipenem (Amostra 2); Esquema alterado para polimixina B, vancomicina e anfotericina B; O paciente evoluiu com piora progressiva e óbito em 29/05/2005.

Seleção in vivo de mutante com ausência de expressão de proteínas de membrana externa (OMPs) Testes de diluição em ágar com e sem inibidor de AmpC (SYN 2190) não demonstraram diferenças de MICs para nenhum dos carbapenems testados; Testes de diluição em ágar com e sem inibidor de bomba de efluxo (reserpina) não demonstraram diferenças de MICs para nenhum dos carbapenems testados; Testes de hidrólise enzimática realizados - Negativos; Detecção fenotípica da produção de ESBL - Negativos;

Seleção in vivo de mutante com ausência de expressão de proteínas de membrana externa (OMPs)

Seleção in vivo de mutante com ausência de expressão de proteínas de membrana externa (OMPs)  B A

Avaliação da expressão de bomba de efluxo (acrA) KPNcs – 33.003 33.399 KPN1963 – 28.458 28.604 acrA KPNcs – 6.314 6.104 KPN1963 – 4.564 4.530 Avaliação da expressão de bomba de efluxo (acrA)

Overexpression ratioc target vs. reference geneb 7.09 KPNcs 5.76 KPN1963 rrsEb 5.06e-09 34.13 13.1 6.62e-08 29.29 acrA Overexpression ratioc Relative expression/ target vs. reference geneb Cta Strain Target gene a - Ct (critical threshold cycle) numbers represent an average from triplicate tests. b - Relative expression = 2-T, where T = Cttarget - Ctreference. c - Ratio between relative expression level of the target gene in the evaluated KPN 1963 strain versus the susceptible K. pneumoniae control strain.

Caso 6 Paciente de 9 anos com leucemia mielóide aguda, imunoodeprimido, internou apresentando picos febris em 02/01/05. Sendo isolado em hemocultura um BGN e posteriormente identificado como Stenotrofomonas malthophilia. Antibiograma: Cefalotina: 256 µg/ml Cefoxitina: 256 µg/ml Cefotaxima: 128 µg/ml Ceftazidima: 256 µg/ml Cefepima: 64 µg/ml Imipenem: 0,5 µg/ml TMP/SMT: 0,25 µg/ml Levofloxacina: 1 µg/ml Tetraciclina: 2 µg/ml

Considerações Antimicrobianos preconizados: TMP/SMT Levofloxacina Minociclina Resistência intrínseca aos ß-lactâmicos Produção de MßL L1 e L2

MECANISMOS DE RESISTÊNCIA ANTIMICROBIANA EM GRAM-NEGATIVOS Characterization of Novel Insertion Sequences in blaIMP-1 Integrons Among Gram-Negative Clinical Isolates in São Paulo, Brazil. RE MENDES, M CASTANHEIRA, MA TOLEMAN, HS SADER, RN JONES, TR WALSH Universidade Federal de São Paulo, São Paulo, Brazil University of Bristol, Bristol, United Kingdom The JONES Group/JMI Laboratories, North liberty, IA 44th ICAAC, C1-298, 2004.

44th ICAAC, C1-298, 2004.

Hibridização de plasmídios contendo blaIMP-1 MECANISMOS DE RESISTÊNCIA ANTIMICROBIANA EM GRAM-NEGATIVOS Hibridização de plasmídios contendo blaIMP-1 Acinetobacter spp. HSP Acinetobacter spp. HSP 501 694 695 696 5248 9043 9033 13304 11775 4978 3486 pGEM 501 694 695 696 5248 9043 9033 13304 11775 4978 3486 pGEM blaIMP-1

Rodrigo Elisandro Mendes Obrigado Rodrigo Elisandro Mendes Laboratório Especial de Microbiologia Clínica – LEMC Laboratório ALERTA Disciplina de Infectologia UNIFESP – EPM Supervisor do Setor de Diagnóstico Molecular AFIP/Medicina Laboratorial rodrigo.mendes@lemc.com.br www.lemc.com.br