EPIGENÉTICA E CÂNCER Roberta H. Lahude Thayse A. Crestani

O QUE SÃO FENÔMENOS EPIGENÉTICOS? São alterações na mudança de expressão de um gene sem modificações na seqüência de bases do DNA.

ONDE OS PROCESSOS EPIGENÉTICOS OCORREM? DNA  METILAÇÃO DNA METILAÇÃO ACETILAÇÃO HISTONAS METILAÇÃO

METILAÇÃO DO DNA - Os dinucleotídeos CpG são uma união de uma citosina a uma guanina por uma ligação fosfodiéster na mesma fita de DNA. A metilação do DNA ocorre normalmente em cerca de 70 a 80% dos sítios CpG, sendo que essa porcentagem aumenta com o envelhecimento.

METILAÇÃO DO DNA Como ocorre: - Adição de grupo metil na posição 5´ da citosina na molécula de DNA - Doador: S-adenosilmetionina - Catalisador: DNA-metiltransferases (vários tipos e isoformas – ex:metiltransferase de manutenção)

METILAÇÃO DO DNA O resultado da metilação do DNA: É o silenciamento dos genes através da inibição direta ou indireta da ligação dos fatores de transcrição devido ao processo de metilação que estes sofreram.

METILAÇÃO DO DNA Função: - É essencial para o desenvolvimento normal - Tem ação : 1. no controle da expressão gênica 2. na integridade cromossômica 3. nos eventos de recombinação.

METILAÇÃO DO DNA A metilação pode ocorrer em 2 regiões ricas em dinucleotídeos CpG distintas: Ilhas CpG Regiões intergênicas (regiões não codificadoras)

METILAÇÃO DO DNA Ilhas CpG: - são regiões com alta frequência do dinucleotídeo CpG. - normalmente presentes nas regiões promotoras em 60% dos genes - encontram-se protegidas da metilação - podem se tornar suscetíveis

HIPOMETILAÇÃO X HIPERMETILAÇÃO A função normal da célula depende de um equilíbrio entre os dois eventos: Ilhas CpG: hipometiladas Regiões intergênicas: hipermetiladas

METILAÇÃO DO DNA E CARCINOGÊNESE Levam a uma variedade de cânceres por alterar a expressão de genes críticos. 2 padrões de metilação distintos: - hipometilação generalizada do genoma - hipermetilação que se apresenta a áreas localizadas dentro da região promotora de genes, as ilhas CpG.

METILAÇÃO DO DNA E CARCINOGÊNESE Hipermetilação de ilhas CpG: silenciamento de genes supressores tumorais e genes de reparo

HIPERMETILAÇÃO DAS ILHAS CpGs. Causas da metilação aumentada (durante envelhecimento e carcinogênese): Processo casual que resulta de erros durante a duplicação do DNA. Erros de pareamento, reconhecidos pelas DNA metiltransferases que provem a hipermetilação. - Exposição a agentes como: radiação, fumo, níquel e outros agentes químicos diversos.

METILAÇÃO DO DNA E CARCINOGÊNESE Hipometilação global: instabilidade cromossômica e ativação de oncogenes

METILAÇÃO DO DNA E CÂNCER

RETINOBLASTOMA É exemplo da metilação exagerada das ilhas CpGs do gene do RB. Ocasiona um silenciamento transcricional levando ao aparecimento do tumor.

PONTOS QUENTES DE MUTAÇÃO Ocorre a desaminação da 5-metilcitosina em timina, originando mutação pontual, podendo alterar a função dos oncogenes e dos genes supressores tumorais. Podem ocorrer devido aos padrões de metilações alterados que afetam indiretamente a atividade gênica.

PONTOS QUENTES DE MUTAÇÃO

CONSEQÜÊNCIAS DOS PROCESSOS EPIGENÉTICOS O silenciamento dos genes através de fenômenos epigenéticos nem sempre acarreta problemas.Exemplos de eventos em que isso ocorre: 1. Regulação da expressão gênica: - Inativação do X - Imprinting genômico 2.Proteção do genoma contra invasão de seqüências de fora do organismo, por exemplo DNA viral Processos neoplásicos

IMPRINTING Somente um dos 2 alelos parentais herdados é normalmente expresso Expressão monoalélica devido a padrão de metilação Processo natural

Genes IGF2 e H19 Cromossomo 11p15.5 Domínio genômico regulado por metilação IGF2-cadeia de 67 aminoácidos com homologia à insulina - alterações metabólicas e promoção do crescimento - normal-somente alelo paterno é expresso H19-ligado ao IGF2; RNA com ação supressora tumoral(provável) - alelo materno

METILAÇÃO NORMAL D M R

Genes IGF2 e H19 Alterações do padrão normal Ativação anormal do alelo normalmente inativo em IGF2 e /ou Silenciamento do alelo normalmente expresso em H19 Interligados

CONSEQUÊNCIAS Perda da heterozigose de um dos genes (geralmente IGF2) que leva a sua expressão modificada pode levar ao mesmo resultado no outro gene. Ativação de um fator de crescimento + silenciamento de um supressor tumoral PROLIFERAÇÃO DESCONTROLADA

HISTONAS Determinam grau de condensação da cromatina Interação entre elas grupamentos adicionados Eventos epigenéticos: -Acetilação -Metilação -Fosforilação -Ubiquitinação -Ribosilação

Processos Epigenéticos

ACETILAÇÃO DAS HISTONAS Controlada pelas acetiltransferases (HATs) e desacetilases (HDACs) Desacetilação:condensa a cromatina , impede a transcrição Acetilação:abre a cromatina,ativa transcrição. Ativação de vários genes inibitórios do crescimento tumoral

METILAÇÃO DAS HISTONAS Efeito depende da histona e do aminoácido metilados: -metilação da histona 3 na lisina 9 facilitam a meti lação do DNA e o silenciamento do gene. -metilação da histona 3 na lisina 4 abre a cromatina, ativando a transcrição.

DNA + HISTONAS Modificação da expressão gênica Interação entre efeitos epigenéticos dos dois níveis Modificação da expressão gênica

Inibidores de HDACs Usados para o aumento da expressão de genes aberrantemente silenciados Provocam acúmulo de histonas acetiladas Diminuem proliferação celular maligna(parada do ciclo em G1 ou G2),e/ou Aumentam grau de diferenciação,e/ou Aumentam apoptose de células malignas

Métodos de análise dos Processos Epigenéticos Enzimas de restrição sensíveis à metilação + PCR PCR-metilação específica (MS-PCR) Seqüenciamento

Métodos de análise dos Processos Epigenéticos Materias utilizados: urina, saliva, sangue, escovados, fragmentos de biópsias

Enzimas de restrição sensíveis à metilação Metilação diferencial Endonuclease HpaII- cliva o DNA no sítio CCGG quando a citosina interna não está metilada Endonuclease MspI- cliva o DNA no sítio CCGG na presença ou ausência de metilação PCR: amplificação de uma banda específica no DNA digerido com HpaII e ausência de amplificação no DNA digerido com MspI.

MS - PCR Detecção do padrão de metilação das ilhas CpG Tratamento do DNA com bissulfito de sódio Conversão de citosinas não metiladas em uracil

MS - PCR DNA isolado de carcinoma prostático (C) e hiperplasia benigna prostática (B) Gene GSTP1-hipermetilação em mais de 90% dos CA prostáticos Ausência de metilação em tumores benignos -Azul:metilado -Verde:desmetilado

SEQÜENCIAMENTO

IMPLICAÇÕES CLÍNICAS Todo processo epigenético tem potencial de ser revertido Marcador molecular para diagnóstico precoce do câncer -não-invasivo Desenvolvimento de novos agentes terapêuticos-inibir metilação -5-azacitidina e 2’-desoxi-5azacitidina(uso experimental) :inibidores da DNA-metiltransferase -menos tóxicos em modelos pré-clínicos -sinérgicos aos desacetilantes de histonas -porém não específicos -efeitos colaterais:trombo e neutropenia Combinação de drogas novas com as convencionais

IMPLICAÇÕES CLÍNICAS Ácido valpróico(anticonvulsivante) Vitamina B3 Drogas já utilizadas para outros fins revertem metilação Ácido valpróico(anticonvulsivante) Vitamina B3 Inibem algumas HDACs

IMPLICAÇÕES CLÍNICAS Dieta Deficiência de folato e vitamina B12: induz metilação Dieta pode causar acúmulo de fênomenos epigenéticos Importante na terapêutica,quando associada a drogas

CONCLUSÃO “A estratégica epigenética, acordando genes silenciados, é uma das maneiras existentes que proporciona a chance das células malignas se regenerarem, se diferenciarem, se tornarem maduras e pertencerem novamente à comunidade do organismo saudável”