BIBLIOTECAS DE DNA ou BANCOS DE DNA FABIANA SEIXAS 3/25/2017 BIBLIOTECAS DE DNA ou BANCOS DE DNA FABIANA SEIXAS email: fabianak@ufpel.edu.br

3/25/2017 TIPOS DE VETORES

VETORES PLASMIDIAIS 3/25/2017 Plasmídios são moléculas de DNA circular, fita dupla, extracromossômico, que ocorrem naturalmente em bactérias e algumas leveduras pUC18 pBR322 pUP310 Ob.: Utilizados para clonar fragmentos de até 9kb

Utilizados para clonar fragmentos de 9kb a 25 kb BACTERIÓFAGO 3/25/2017 Vírus que infectam bactérias; DNA ou RNA; Capsídeo Biologia do fago Utilizados para clonar fragmentos de 9kb a 25 kb

São híbridos entre plasmídios e bacteriófagos; 3/25/2017 COSMÍDEOS São híbridos entre plasmídios e bacteriófagos; - Utilizados para clonar fragmentos de 25 a 35 kb;

3/25/2017 DNA RECOMBINANTE

3/25/2017 Bibliotecas de DNA DNA Genômico cDNA

BIBLIOTECAS DE DNA GENÔMICO 3/25/2017 BIBLIOTECAS DE DNA GENÔMICO É uma coleção de clones que representam a totalidade do genoma de um determinado organismo Consiste de todas as moléculas de DNA recombinantes que foram geradas pela ligação do DNA do organismo a um vetor (plasmideo, bacteriófago ou cosmídeo) Servem para isolar DNA específicos de um organismo

BIBLIOTECAS DE DNA GENÔMICO 3/25/2017 BIBLIOTECAS DE DNA GENÔMICO CARACTERÍSTICAS São usadas principalmente para procariotos Em eucariotos usa-se biblioteca genômica para estudo de regiões reguladoras Independe do tipo de célula utilizada para a obtenção do DNA

BIBLIOTECAS DE DNA GENÔMICO 3/25/2017 BIBLIOTECAS DE DNA GENÔMICO - Representa todo o genoma de um organismo

BIBLIOTECAS DE DNA GENÔMICO - Fagos 3/25/2017 BIBLIOTECAS DE DNA GENÔMICO - Fagos

BIBLIOTECAS DE DNA GENÔMICO 3/25/2017 BIBLIOTECAS DE DNA GENÔMICO

BIBLIOTECAS DE DNA GENÔMICO - Aplicações 3/25/2017 BIBLIOTECAS DE DNA GENÔMICO - Aplicações

BIBLIOTECAS DE cDNA BIBLIOTECAS DE cDNA 3/25/2017 BIBLIOTECAS DE cDNA É o conjunto de clones das seqüências codificadoras que estão sendo expressas pela célula naquele momento, obtido através da clonagem de moléculas cópias do mRNA. É usada principalmente para células eucarióticas. Varia de acordo com o tecido utilizado.

3/25/2017 BIBLIOTECAS DE cDNA

SINTESE DE cDNA Purificação do RNA Hibridização com poly(dT) 3/25/2017 SINTESE DE cDNA Purificação do RNA Hibridização com poly(dT) Copia do DNA com RT Degradação do RNA Síntese de uma fita complementar

3/25/2017 BIBLIOTECAS DE cDNA

Clonagem de cDNA em fago  3/25/2017 BIBLIOTECAS DE DNA GENÔMICO Clonagem de cDNA em fago 

BIBLIOTECAS DE DNA GENÔMICO 3/25/2017 Etapas na construção de uma Biblioteca genômica e de cDNA

BIBLIOTECAS DIFERENÇAS Biblioteca genômica: 3/25/2017 BIBLIOTECAS DIFERENÇAS Biblioteca genômica: Representam uma amostra aleatória de todas as seqüências de DNA de um organismo Biblioteca de cDNA Contém moléculas que foram transcritas em mRNA Produção de grande quantidade de mRNA por células especializadas Varia de acordo com tipo e estado fisiológico da célula mRNA é processado

BIBLIOTECAS DE DNA GENÔMICO 3/25/2017 BIBLIOTECAS DE DNA GENÔMICO Utilização de bibliotecas Seqüenciamento de todos os insertos usando iniciadores do vetor Screening Projetos genoma / transcriptoma

TRIAGEM DE UMA BIBLIOTECA 3/25/2017 TRIAGEM DE UMA BIBLIOTECA Detecção do produto do gene pela utilização de anticorpos Detecção do DNA através da técnica de hibridização

Triagem de uma biblioteca 3/25/2017 Triagem de uma biblioteca Conhecer parte da seqüência do gene Sequência completa do gene Sonda de DNA Utilizar sonda de oligonucleotídeos derivado de uma proteína Codon degenerado Conhecer cerca de 6aa contíguos Anticorpos

1- Detecção do produto do gene pelo uso de anticorpos Triagem de uma biblioteca 3/25/2017 1- Detecção do produto do gene pelo uso de anticorpos

1- Detecção do produto do gene pelo uso de anticorpos Triagem de uma biblioteca 3/25/2017 1- Detecção do produto do gene pelo uso de anticorpos

Triagem de uma biblioteca 3/25/2017 Triagem de uma biblioteca 2- Detecção do DNA através da técnica de hibridização HIBRIDIZAÇÃO DOS ÁCIDOS NUCLEICOS É a formação de molécula fita dupla, através do pareamento de duas fitas de DNA ou uma de DNA e outra de RNA complementares, mas de origens diferentes Hibridização  Renaturação

Triagem de uma biblioteca 3/25/2017 SONDA de DNA - Seqüência de DNA Marcada Marcação da Sonda de DNA Radioativa: 32P – nick traslation Enzimática: peroxidase, fosfatase alcalina

Triagem de uma biblioteca 3/25/2017 Marcação da Sonda de DNA Radioativa: 32P – nick traslation Cortar o DNA fita dupla DNA fita simples Moléculas de DNA radioativas Sondas Atividade Exonucleasica da DNA polimerase DNA polimerase preenche com nucleotídeos marcados

Triagem de uma biblioteca 3/25/2017 Marcação da Sonda de DNA Enzimática: peroxidase, fosfatase alcalina Desnaturação DNA DNA fita simples + peroxidase complexada com polimero positivo Ligação Fraca (DNA+ Peroxidase) + glutaraldeído Sondas Covalentemente marcada com a enzima

2- Detecção do DNA através da técnica de hibridização Triagem de uma biblioteca 3/25/2017 2- Detecção do DNA através da técnica de hibridização Placas com Colônias contendo os plasmídeos 1 Lise das Bactérias – Desnaturação do DNA 3 2 4 6 5 Sonda Filme de Raio - X

2- Detecção do DNA através da técnica de hibridização Triagem de uma biblioteca 3/25/2017 2- Detecção do DNA através da técnica de hibridização

Caracterização da seqüência encontrada Triagem de uma biblioteca 3/25/2017 Caracterização da seqüência encontrada Seqüenciamento de DNA PCR Expressão da sequência codificadora

Técnicas de Hibridização 3/25/2017 Southern Blot - DNA Northern Blot - RNA Western Blot - Proteína

Southern Blot – RNA Sonda: seqüência de DNA marcada 3/25/2017 Sonda: seqüência de DNA marcada Transferência de DNA do gel para a membrana

Northern Blot – RNA 1. Extração do DNA 4. Geração de uma sonda marcada 3/25/2017 Northern Blot – RNA 1. Extração do DNA 4. Geração de uma sonda marcada dATP dGTP dTTP dCTP pGEM-T 2. Eletroforese do RNA 5. Hibridização 6. Visualização Northern blotting allows easy and more or less quantitative detection of a limited number of transcripts. Total RNA (or mRNA) is separated on an agarose gel and transferred to a nylon membrane. This membrane is then incubated with a radiolabeled probe derived from the gene of interest. After hybridization, size and amount of the corresponding transcript in the RNA pool are revealed by autoradiography. The method is not very sensitive. 3. Transferencia para a menbrana

3/25/2017 Trabalho Prático 1