DIAGNÓSTICO PRÉ-NATAL E PRÉ-IMPLANTAÇÃO GENÉTICA II Profa. Dra. Ana Elizabete Silva

Diagnóstico Pré-natal (DPN) e Diagnóstico Pré-Implantação (DPI) Como fazer um super bebê livre de câncer de mama, outros cânceres hereditários e doenças genéticas? Diagnóstico Pré-natal (DPN) e Diagnóstico Pré-Implantação (DPI) Inglaterra-2009: -família com 3 gerações de mulheres com câncer de mama hereditário (mutação BRCA1) -fertilização in vitro e DPI -11 embriões e implantação de 2 sem mutação BRCA1 Inglaterra-2013: -mãe portadora da mutação p53 – S. Li-Fraumeni -filho 3 anos falecido com câncer de cérebro ICSI e DPI:2 embriões, 1 s/mutação implantado

DIAGNÓSTICO PRÉ-NATAL Fornece informações ao casal para que eles tomem as decisões necessárias como: Levar à gravidez à termo Preparar-se para um parto difícil e os cuidados especiais necessários ao recém-nascido Tranquilizar e reduzir a ansiedade Terminalização da gestação ~98% casos: resultado normal

Abortos devido ao DPN: 2% DPN  não exclui todos os defeitos fetais possíveis  distúrbio específico. DPN  Equipe Multidisciplinar: obstetrícia e ultra-sonografia, genética clínica (avaliação, diagnóstico e informação), Exames laboratoriais (citogenética, bioquímica e análise do DNA) Aconselhamento Genético antes e após o exame (riscos e limitações, consentimento, repetições, exames adicionais)

DIAGNÓSTICO PRÉ-NATAL Filho anterior com anomalia Anomalias cromossômicas em um dos genitores Idade materna avançada INDICAÇÕES PARA O DPN Abortos espontâneos Anomalias fetais História familiar de distúrbios genéticos Risco de defeito de tubo neural Consanguinidade entre os cônjuges

MÉTODOS DE DIAGNÓSTICO PRÉ-NATAL Testes não- invasivos Ultra-sonografia Marcadores Bioquímicos: Triagem tripla do soro materno Isolamento de células fetais da circulação materna Nenhum risco para o feto Amplamente indicados

MÉTODOS DE DIAGNÓSTICO PRÉ-NATAL Testes invasivos Amniocentese Punção de vilosidades coriônicas (CVS) Cordocentese risco de aborto indicado na minoria das gestações

CASO CLÍNICO Um casal jovem sem história familial de doenças genéticas na família procura o obstetra devido gravidez de 13 semanas. A gravidez parece estar normal, mas o médico indicou testes de diagnóstico pré-natal não invasivos para tranquilizar o casal: ultrassom; translucência nucal triagem tripla do soro materno.

CASO CLÍNICO O teste de triagem tripla indicou aumento de alfa-fetoproteína, sugestivo de defeito de fechamento de tubo neural (espinha bífida, mielomenigocele, anencefalia) Posterior exame de ultrassom revelou uma massa cística na região lombar diagnosticada como espinha bífida cística; O médico encaminhou para o geneticista para o aconselhamento genético adequado e recomendou o parto por cesária para evitar risco de rompimento do cisto e acompanhamento da gestação com outros exames de US para monitorar inclusive a ocorrência de hidrocefalia.

CASO CLÍNICO O casal foi orientado quanto ao risco de recorrência para o próximo filho (4%); inclusive anencefalia – herança multifatorial suplementação com ácido fólico nas próximas gestações: dois meses antes da gravidez até um mês após a concepção; A criança nasceu bem, sem sinal de hidrocefalia. Após correção cirúrgica tem bom desenvolvimento, com controle da bexiga e intestino e já aprendeu a falar. O casal estão planejando uma segunda gravidez!!!

MÉTODOS DE DIAGNÓSTICO PRÉ-NATAL TESTES NÃO-INVASIVOS

TÉCNICAS NÃO INVASIVAS Ultra-Sonografia Emissão de ondas sonoras  Abdome da mulher grávida transdutor emite e recebe o som por sinais acústicos convertidos em sinais elétricos amplificados e visualizados em um monitor Tecido fetal reflete as ondas em padrões conforme à densidade do tecido

INDICAÇÕES Sangramentos Distúrbios de crescimento fetal Gestações múltiplas Análise direta da anatomia interna e externa Apresentação e posição Vitalidade Quantidade de líquido amniótico Idade gestacional e fetal Localização da placenta Morfologia fetal (11a semana)

DISTÚRBIOS MONOGÊNICOS Displasias esqueléticas Doença renal policística DISTÚRBIOS MULTIFATORIAIS Cardiopatias congênitas DTNs (anencefalia, espinha bífida) fenda labial e palatina ANOMALIAS INDICADORAS DE SÍNDROMES Fácies anormal Genitália anormal Higroma cístico Polidactilia

1o trimestre 8 meses

DEFEITOS DE FECHAMENTO DO TUBO NEURAL VISUALIZADOS POR ULTRA-SOM Polidactilia Anencefalia

Onfalocele Pé torto Fenda labial

TRANSLUCÊNCIA NUCAL FETAL (NT) Marcador Ultrassonográfico Medida da região entre a pele e o tecido mole que recobre a coluna cervical Realizada entre a 10a e 14a semana NT: acúmulo de líquido posterior ao pescoço fetal risco de cromossomopatias (S.Down, S.Noomam, Higroma cístico e cardiopatias) 2,5 - 3,9 mm: risco 3x 4 - 4,9 mm: risco 18x Acima de 5 mm: 13% aborto

MARCADORES BIOQUÍMICOS Triagem Tripla no Soro Materno: Alfa-fetoproteina (AFP):proteína fetal (saco vitelínico e fígado) Beta-gonadotrofina coriônica (β-hCG): produzido pelos trofoblastos Estriol (uE3): produzido pelo feto (gl. Adrenal e metabolizado pela placenta) Triagem Tripla associada com idade materna avançada FETO COM CROMOSSOMOPATIA

MARCADORES BIOQUÍMICOS TRIAGEM TRIPLA Dosagem de 3 marcadores no sangue materno: AFP, uE3 (estriol não conjugado) e HCG (Gonadotrofina coriônica Humana) 15a a 20a semana Idade materna  + AFPSM  + uE3  + HCG  Gestações com  risco de Síndrome de Down AFP uE3 HCG Risco aumentado de Síndrome de Down   Trissomia do 18 NTD -

CÉLULAS FETAIS ISOLADAS DO SANGUE MATERNO Hemáceas nucleadas (comuns no feto) Isoladas na 8a semana Análise FISH → trissomias PCR → distúrbios monogênicos → sexo fetal : gene SRY (Lo et al., 1998) Nenhum risco para o feto Dificuldade: separar populações puras de células fetais

MÉTODOS INVASIVOS

AMNIOCENTESE Serr et al (1955): determinação do sexo por exame da cromatina X (líquido amniótico) precoce: 12a a 14a semana Período tradicional: 14a - 17a semana Coleta de uma amostra do líquido amniótico (células fetais) via transabdominal com uma seringa (20 ml)  monitorada por ultrassonografia sobrenadante: dosagem de AFP e outras doenças metabólicas sedimento: cultura: cariótipo e/ou extração de DNA

Células fetais Cultivo Testes diagnósticos Testes diagnósticos Amniocentese Testes invasivos Diagnóstico pré-natal Células fetais Cultivo Testes diagnósticos Testes diagnósticos

vias respiratórias, pele, boca Coleta de líquido amniótico guiada por ultrassom, após anestesia local ou não Células descamadas da bexiga, vias respiratórias, pele, boca TV GENE - Diagnóstico Pré-Natal

0,1% deformidade de membros Complicações aspiração de sangue materno Resultado: 2- 3 semanas Riscos: 0,2 - 0,5% de induzir aborto 0,1% deformidade de membros Complicações aspiração de sangue materno Imunização por Rh da mãe (Rh-) acidentes de punção Infecção materna perda de líquido (raro) diagnóstico mais tardio

ALFA-FETOPROTEÍNA do Líquido Amniótico rastreamento de fetos com DTN aberto  AFP 95% dos bebês com DTNs nascem em famílias sem história conhecida espinha bífida e anencefalias são detectadas (99%) Período: 15a a 18a semana AFPSM (16-18 semanas) : maior que 2,5 influência de outros fatores (morte fetal, gêmeos)  AFPSM  S. Down ou outros defeitos cromossômicos Suplementação com ácido fólico: 1 mês antes da concepção e durante o 1º trimestre de gestação  Em 75% os NTD

Coleta de amostras das vilosidades coriônicas (CAVC) tecido do trofoblasto (estruturas digitiformes) da área vilosa do cório (placenta) via transcervical ou transabdominal (monitorização ultrassonográfica) período variável  8a - 12ª semana Complicações: - sangramento ou aborto (1%) - risco de defeitos de redução de membros - sucesso da análise cromossômica é menor - CAVC falha  amniocentese subsequente

Biópsia de vilo corial -cateter acoplado a seringa com meio de cultura -aspiração de ~50mg de vilo corial -cultura de curta duração (24h) -resultado em 1-3 dias http://laboratoriogene.info/TVGENE/DXPN.htm

Coleta transabdominal Coleta transcervical Coleta transabdominal Vantagem em relação à amniocentese: culturas de curta duração Desvantagem: -medição da AFP não pode ser realizada -mosaicismo placentário (1-2%) INDICAÇÕES: doenças metabólicas extração DNA cariótipo

CORDOCENTESE amostra de sangue fetal do cordão umbilical (linfócitos) período: a partir da 18 semana Aplicações: presença de alguma anormalidade fetal detectada pela ultra-sonografia falha nas culturas de amniocentese e vilo corial cultura de células de línfócitos – curta duração (2-3 dias) extração de DNA Hemoglobinopatias e doenças hematológicas

-Colheita de 1 – 6 ml de sangue – veia umbilical - Risco de aborto: até 3% acima da média normal -Complicação: hemorragia no sítio de punção

Cordocentese Amostra direta do cordão umbilical Diagnóstico pré-natal Cordocentese Amostra direta do cordão umbilical 18ª a 21ª semana de gestação Alguns dias... análise Cultura de células

O que fazer com o material coletado? Diagnóstico pré-natal Testes invasivos O que fazer com o material coletado? Cultura Cariotipagem FISH Análises no DNA Aneuploidias (13,18,21,X, Y) Análises bioquímicas

EXAMES LABORATORIAIS A PARTIR DE MATERIAL COLETADO CARIÓTIPO culturas de curta duração (48-72 horas) resultado ~2 semanas Cariótipo mostrando Síndrome do duplo Y

EXAMES LABORATORIAIS A PARTIR DE MATERIAL COLETADO CITOGENÉTICA MOLECULAR - FISH núcleos interfásicos  aneuploidias (13, 18, 21, X e Y) Normal Trissomia do 21 Triplo X

detecção direta da mutação Exemplos: ANÁLISE DO DNA marcadores específicos detecção direta da mutação Exemplos: Distrofia Muscular Duchenne  deleções de genes ou rearranjos Anemia falciforme, Hemofilia A  mutações puntiformes doença de Tay-Sachs ou Fibrose cística  mutações específicas.

97- 98%

ABORTO SELETIVO Quando uma anomalia fetal deve ser considerada grave a ponto de justificar a interrupção da gestação? E as doenças de manifestação tardia e progressiva?

DIAGNÓSTICO GENÉTICO PRÉ-IMPLANTAÇÃO

DIAGNÓSTICO PRÉ-IMPLANTAÇÃO Selecionar embriões livres de doença genética para implantação no útero OBJETIVO Biópsia - Blastômero Pré-Concepção Remoção do 1o. ou 2o. corpúsculo polar  Não está envolvido com o desenvolvimento do embrião Remoção de um blastômero  Células totipotentes Não afeta embrião

DIAGNÓSTICO PRÉ-IMPLANTAÇÃO INDICAÇÕES Abortos anteriores de causa desconhecida Idade materna avançada Rearranjos estruturais nos genitores Mutações gênicas Mosaicismo gonadal

DIAGNÓSTICO PRÉ-IMPLANTAÇÃO Pré-Concepção ou Biopsia de Corpúsculo Polar DNA do corpúsculo polar → conter mutação causadora de doença → ovócito não contém → é então fertilizado e implantado - Desvantagem: não detecta aneuploidias paternas e anomalias após a fertilização - Método caro e limitado

DIAGNÓSTICO PRÉ-IMPLANTAÇÃO Biópsia de Blastômero Análise genética de 1-2 blastômeros removidos por micromanipulação no estágio de 8 células (3 dias), após fertilização in vitro DNA da célula biopsiada → amplificado por PCR e submetido a testes moleculares para verificação de várias doenças → mutações gênicas DMD Fibrose Cística Talassemia beta Doenças ligadas ao X Doença de Tay-Sachs Hemofilia Doença de Huntington Retinite pigmentosa Síndrome de Marfan Anemia de Fanconi Síndrome do X frágil

DIAGNÓSTICO PRÉ-IMPLANTAÇÃO Biópsia ANÁLISE DO DNA DA CÉLULA BIOPSIADA FISH - mulheres > 35 anos - célula fetal fixada em lâmina - Utilização de sondas específicas - 90% de eficiência PERSPECTIVA DNA de 1 única célula amplificado e hibridizado contra um chip de centenas de marcadores FISH: Sinais para X e Y FISH: Trissomia do 21

DIAGNÓSTICO PRÉ-IMPLANTAÇÃO Biópsia Embriões não afetados Embriões afetados Implantados Descartados Vantagem: evitar a implantação de embrião inviável. Questão ética: Seleção da vida em fase cada vez mais precoce Em que momento se inicia a vida?

Blastocisto no estágio de 6 células Embrião triplóide ~50% dos embriões após FIV apresentam anomalias cromossômicas -4,9% presença de malformações congênitas -PGD aumenta a taxa de implantação (40%)

ACONSELHAMENTO GENÉTICO Sheldon Reed (1947): “concenciosamente dava respostas cuidadosas a questões genéticas indagadas por pais ansiosos” (serviço genético social) ACONSELHAMENTO GENÉTICO Atualmente: Consulta Médica - “processo pelo qual um indivíduos ou família obtém informações sobre um problema genético real ou possível”

EUGENIA ACONSELHAMENTO GENÉTICO Francis Galton (1883): “Ciência que estuda as condições mais apropriadas à reprodução e melhoramento da espécie humana” (ideal eugênico= higiene racial) Melhoria de uma população pela seleção dos melhores para reprodução Cruzamentos seletivos para melhorar a espécie humana→ movimento eugenista Londres (1908): fundada a “Sociedade Eugênica” – primeira organização a defender os ideais eugênicos

No Brasil (1918):Sociedade Paulista de Eugenia ACONSELHAMENTO GENÉTICO No Brasil (1918):Sociedade Paulista de Eugenia 1929: 1o. Congresso Brasileiro de Eugenismo (RJ) “O Problema Eugênico da Migração”  exclusão de todas as imigrações não-brancas -Posteriormente brasileiros famosos como Monteiro Lobato, D. Hélder Câmara, Miguel Reale, Leonel Brizola

Aplicação pelos nazistas para justificar a eliminação de: -judeus EUGENIA ACONSELHAMENTO GENÉTICO Aplicação pelos nazistas para justificar a eliminação de: -judeus -ciganos -poloneses -negros -deficientes mentais -homossexuais Movimentos anti-imigração e racial (Estados Unidos): higiene ou profilaxia racial Esterilização e eutanásia involuntária: debilidade mental, pobreza, prostituição, criminalidade, alcoolismo, epilepsia, malformações, grupos étnicos

ACONSELHAMENTO GENÉTICO EUGENIA Garver & Garver (1991): “ciência que lida com todas as influências que melhora a qualidade inata da raça humana, particularmente pelo controle dos fatores hereditários”. Programa de Eugênia – Dificuldades: Quais características são verdadeiramente hereditárias? Questões éticas: quem decide qual característica é mais desejável que outra?

ETAPAS DO ACONSELHAMENTO GENÉTICO Entrevista: -história familiar/heredograma 2. Exame clínico: -aspecto geral do paciente; medidas antropométricas e exame específico 3. Exames complementares: -cariótipo, moleculares, -bioquímicos -radiográficos

ETAPAS DO ACONSELHAMENTO GENÉTICO 4. Hipótese diagnóstica: -causa genética ou ambiental; cromossômica, monogênica, ou multifatorial. estabelecer o padrão de herança e risco de recorrência 5. Laudo: relatório com diagnóstico da doença, informações do quadro clínico, causa, prognóstico, evolução, conduta terapêutica, risco de recorrência, necessidade de investigação de outros membros da família ou diagnóstico pré-natal