Elementos reguladores estágio/linhagem específicos durante a recombinação V-(D)-J do locus da imunoglobulina Fabrício Souto Giuliano Bonfá Juliana Ueda

Recombinação e expressão gênica da imunoglobulina Cada clone de linfócitos B ou T produz um receptor com uma particular estrutura de ligação ao antígeno e a variabilidade de rearranjos possíveis ~107

Desenvolvimento da célula B e a recombinação dos segmentos gênicos de imunoglobulinas (Ig) Célula pró-B precoce Célula pró-B tardia Célula pré-B grande Célula pré-B pequena Célula B imatura Célula B madura

Desenvolvimento da célula B e a recombinação dos segmentos gênicos de imunoglobulinas (Ig)

Os genes RAG possuem importantes propriedades As proteínas RAG1 e RAG2 são específicas para determinado tipo celular, sendo produzidas somente em linfócitos T e B; Os genes RAG são expressos somente nos linfócitos B e T imaturos, mas não em células B e T maduras; Os genes RAG são expressos nas fases G0 e G1 do ciclo celular e são silenciados nas células em proliferação.

Controle da recombinação por mecanismos epigenéticos Histonas: H3K9ac; H3K4me2; H3K4me3 (marcadores de histonas ativas)

Os loci de Igh e Igk estão posicionados na região central do núcleo no estágio pro-B

Locus da cadeia pesada da imunoglobulina (Igh)

Retirada do circulo de DNA A interação RAG - RSS leva a clivagem do DNA permitindo a recombinação entre V e DJ e exclusão dos genes V não relevantes Retirada do circulo de DNA V2 V3 V4 V8 V7 V6 V9 V5 D J V2 V3 V4 V8 V7 V6 V5 V9 V1 RAG1/2 C Formação do loop, retirada do DNA D J V1 C Cadeia Pesada Ig

Fatores envolvidos na contração e looping da cromatina Fator de ligação CCCTC (CTCF) Atividade de insulator (impede a atividade dos enhancers ou impede a condensação da cromatina)

CTCF e cohesina são necessários durante a recombinação dos genes da imunoglobulina?? Giuliano Bonfá

Fator de transcrição envolvido no rearranjo da Ig

Fator de transcrição envolvido na contração do locus Igh Conhecido como proteína ativadora de células B (BASP, B-cell activator protein)

A contração do locus Igh é dependente de Pax5

Juliana Ueda

Objetivo: Identificar fatores nucleares responsáveis por regular a contração cromossômica e formação dos “loops”, favorecendo a recombinação V(D)J em um determinado estágio de desenvolvimento das células B.

Animais e metodologia medula óssea RAG-/- ChIP-chip (MAT software) CD19+ µ+RAG-/- B6 MEF RAG-/- medula óssea ChIP  qPCR µ+RAG-/- CD19+ B6 Timócitos B6 MEF  fibroblastos embrionários de camundongos B6 µ+RAG-/-  com gene IgH rearranjado (pré-B)

ChIP-chip Author: Thomas Hentrich

Qual a localização dos sítios de ligação para CTCF no cromossomo 12? ChIP-chip  Affymetrix mouse tiling array E Sítios de CTCF estão espalhados em todo cromossomo, com maior frequência no locus Igh em células pró e pré-B.

Qual a localização dos sítios de ligação para CTCF no locus Igh? ChIP-chip 8 CTCF 12 CTCF 33 CTCF VH=53 Dois sítios posicionados na porção 5’ do gene DH e os demais espalhados no locus VH ,principalmente na porção distal.

A ligação de CTCF no locus VH é similar nos diferentes tipos celulares Qual a diferença de ligação de CTCF em células pró-B, pré-B e Timócitos no locus Igh? ChIP  qPCR A ligação de CTCF no locus VH é similar nos diferentes tipos celulares B6 MEF  fibroblastos embrionários de camundongos B6

Coesina (Rad21) participa do complexo, ligando-se à sítios de CTCF no locus Igh? ChIP  qPCR Coesina co-localiza com CTCF em todo o locus Igh, preferencialmente em pro-B

Como estão distribuídos os sítios para CTCF no cromossomo 6? ChIP-chip  Affymetrix mouse tiling array F Os sítios para CTCF no cromossomo 6 são distribuídos igualmente nas células pro e pre-B

Como estão distribuídos os sítios para CTCF no locus Igκ? ChIP-chip Sis  elemento regulador negativo do rearranjo 4 CTCF Vκ 11 CTCF Vκ Poucos sítios CTCF em comparação com Igh, com 11 em pre-B e apenas 4 em pro-B na região Vκ

Células pre-B apresentam maior ligação de CTCF e coesina no locus Igκ Qual a diferença de ligação de CTCF e Coesina em células pró-B, pré-B e Timócitos no locus Igκ? ChIP  qPCR Células pre-B apresentam maior ligação de CTCF e coesina no locus Igκ

Há sítios de CTCF presentes no locus Igλ? ChIP-chip 3 CTCF Em pro e pre-B há poucos (3), mas fortes sítios para CTCF

Qual a diferença de ligação de CTCF e Coesina no locus Igλ? ChIP  qPCR CTCF e coesina ligam-se mais em pre-B nos 2 sítios 5’

Conclusão  CTCF está presente em todos loci da Ig;  CTCF é estágio-específico apenas nos loci κ e λ ; Coesina co-localiza com CTCF e juntas são estágio-especifica e linhagem-específica para todos os loci da Ig; Juntas são importantes na formação dos “loops” e contração do locus V. “Modelo Roseta”

Objetivo: Identificar elementos reguladores no locus da Igh

Célula Pró-B Pax5 -/- Célula Pró-B Pax5+/+ Elementos reguladores geralmente estão presentes em regiões de cromatina ativa Camundongo RAG-/- Camundongo RAG-/- Pax5-/- Medula óssea CD220+ CD19+ C-Kit+ CD25- IgM- Célula Pró-B Pax5+/+ Célula Pró-B Pax5 -/- Cultivadas 4-5d IL-7 Imunoprecipitação H3K4me2 H3K9ac H3K4me3 Pax5 CTCF

Há regiões intergênicas com cromatina ativa nas porções central e proximal do locus Igh? Diferentes famílias Preto: VHJ558 Rosa: VH3609 - Poucas regiões intergênicas com cromatina ativa nas porções central e proximal do locus Igh - Ausência da histona H3K4me3: promotor não ativo

Há regiões intergênicas com cromatina ativa na porção distal do locus Igh? Família VH3609: únicos genes da porção distal que possuem cromatina ativa Genes VH3609 + H3K4me2 + H3K9ac Identificação regiões com cromatina ativa upstream genes VH3609 + H3K4me2 + H3K9ac + H3K4me3 (promores ativos) Pax5 -/-

Há regiões intergênicas com cromatina ativa na porção distal do locus Igh? Pax5 : sítios de ligação nos genes VH3609 Céls Pró-B Pax5 -/- Genes VH3609 continuam com cromatina ativa: Independente de Pax5 Pax5: sítios de ligação nas regiões upstream Céls Pró-B Pax5 -/- Regiões upstream deixam de apresentar cromatina ativa Dependente de Pax5 CTCF: sítios de ligação nas regiões upstream, independente de Pax5 Pax5 -/-

Porção distal do locus Igh: Há regiões intergênicas com cromatina ativa na porção distal do locus Igh? Estes dados indicam… Porção distal do locus Igh: Presença de elementos associados aos genes VH3609 Com sítios de ligação Pax5 e CTCF Cromatina ativa é dependente de Pax5 Genes família VH3609

Esses elementos associados aos genes VH3609 são conservados? Identificados 14 cópias de sequências repetidas conservadas na região distal do locus da Igh Ausentes no restante do genoma murino Elementos depentendes de Pax5 para indução de cromatina ativa nas céls pró-B: PAIR PAIR: Pax5-Activated Intergenic Repeats

11 PAIRs upstream VH3609 genes CTCF: liga-se a todos PAIR 85 sítios (distal e proximal) PAX5: 14 Síitos de ligação 1/3 distal 7:central/proximal 4 região 3’ locus

Esses elementos associados a VH3609 são conservados? PAIR: 470bp 4 subfamílias Associação subfamílias PAIRs com genes VH3609

Os diferentes PAIRs posuem sítios de ligação para os fatores de transcrição CTCF, E2A e Pax5? In vivo footprint: Macrófago (MO), pró-B (Rag2-/- Pax5+/+ ou Pax5-/-) tratamento DMS + piperidina CTCF Forte footprint PAIR4 Fraco footprint PAIR6 e 7 Ausente Macrófagos DMS: dimethyl sulfate

Padrão footprint semelhante entre os PAIRs Os diferentes PAIRs posuem sítios de ligação para os fatores de transcrição CTCF, E2A e Pax5? In vivo footprint E2A Padrão footprint semelhante entre os PAIRs

Interação de CTCF, E2A e Pax5 em diferentes PAIRs no início Os diferentes PAIRs posuem sítios de ligação para os fatores de transcrição CTCF, E2A e Pax5? In vivo footprint Interação de CTCF, E2A e Pax5 em diferentes PAIRs no início do desenvolvimento de céls B CTCF ---- E2A ----Pax5

Os sítios de ligação dos fatores de transcrição são conservados nos diferentes PAIRs? 10 dos 14 PAIRs possuem sítios idênticos de ligação do CTCF 10 dos 14 PAIRs possuem sítios idênticos de ligação do EA2 9 dos 14 PAIRs possuem sítios idênticos de ligação do Pax5

Extrato nuclear (pró-B) Sonda (PAIR7)* Competidores Confirmando a ligação dos fatores de transcrição nestas regiões…. Extrato nuclear (pró-B) Sonda (PAIR7)* Competidores Ensaio de mobilidade eletroforética Oligonucleotídeos não marcados PAIR7 tem afinidade (alta) semelhante aos sítios presentes em uE5 ekE2 (1989)

Extrato nuclear (pró-B) Sonda (PAIR7)* Competidores Confirmando a ligação dos fatores de transcrição nestas regiões…. Extrato nuclear (pró-B) Sonda (PAIR7)* Competidores Ensaio de mobilidade eletroforética Oligonucleotídeos não marcados O sítio de ligação de Pax5 em PAIR7 possui a mesma afinidade que sítio “referência”(promotor Cd19) e que uma única substituição de nucleotídeos (PAIR10), inserção de um resíduo A (PAIR8) ou substituição de 3pb (PAIR7M) inibe ligação de PAx5

Investigação da atividade transcricional antisense dos PAIRs Facilitar ligação RAG Menor transcrição Menor rearranjo Cél Pró-B Rag2-/- Isolamento RNA Poly A+ RT-PCR éxons 1 e 2 (antisense) Unspliced (u) Spliced (s)

Investigação da atividade transcricional antisense dos PAIRs Céls Pró-B, Pré-B, células B imaturas, cél T DP (sorted) Extração RNA RT-PCR éxons 1 e 2 (antisense) Unspliced (u) Spliced (s) A transcrição antisense originada pelos PAIRs analisados é dependente de Pax5 e restrita ao estágio de célula pró-B

enhancer dependente de Pax5 Atividade transcricional de PAIR4 e PAIR7 Investigação da atividade transcricional dos PAIR4 Ensaio de transcrição transiente Cél pró-B Transfecção PAIR4 + promotor luciferase 24 horas : quantificação transcrição gene luciferase Funciona como um enhancer dependente de Pax5 Esses PAIRs funcionam como elementos reguladores da transcrição em células pró-B transfectadas * Mutação sítio de Pax5

desenvolvimento da célula B? Estes fatores de transcrição ligam-se aos PAIRs ns próximos estágios de desenvolvimento da célula B? Na célula pré-B: CTCF: Menor PAIR4 = PAIR 6 e 7 E2A: Semelhante Pax5 Ausente Pax5 se liga de forma eficiente em células pró-B, mas não nos estágios seguintes de desenvolvimento, fazendo com que esses elementos permaneçam inativos nas céls pré-B

Quais são os sítios de ligação de CTCF nos próximos estágios de desenvolvimento da célula B? Rag-/- Céls Pró-B (MO), células B maduras (LN), cél T DP (T) ChiP Anticorpo anti-CTCF Padrão e intensidade de ligação similar de CTCF e Rad21 na região regulatória 3’RR e na região proximal dos genes Vh nos 3 tipos celulares

Quais são os sítios de ligação de CTCF nos próximos estágios de desenvolvimento da célula B? CTCF: interage com todos os PAIRs (cél pró-B), com eficiência diferente Rad21: mesmo padrão CTCF CTCF: redução/ausência de ligação nos estágio cél B madura e cél T DP (exc. PAIR4) CTCF e Rad21: interagem preferencialmente nos elementos PAIRs em células pró-B

Conclusão Região distal do locus da Igh: Elementos reguladores dependentes de Pax5 Sítios de ligação para CTCF, E2A e Pax5 Transcrição antisense dependente de PAx5 (pró-B) Regulação da recombinação distal VhH- DJ no locus da Igh