“The Knowledge of nature” Processo Symbios “The Knowledge of nature” Conceição Oliveira, IST, 22 Março de 2006

Prevenir a formação de TCA em cortiça Objectivo Prevenir a formação de TCA em cortiça

Problema: Formação de 2,4,6-tricloroanisole na cortiça Abordagem Científica Problema: Formação de 2,4,6-tricloroanisole na cortiça Compilação e análise crítica do conhecimento científico e empírico reportado ao problema; Enquadrar o problema no domínio dos processos biológicos da natureza. Direccionar o foco de atenção, não para o composto em si, mas para os mecanismos que conduzem à sua formação na matriz cortiça; Perspectivando uma solução de cariz preventivo

Abordagem Científica De um modo abrangente, A acção dos microorganismos é um facto incontornável no mundo que nos rodeia; A sua acção revela-se não só necessária como essencial ao equilíbrio e manutenção dos ecossistemas; Sendo uma organização biológica, os microrganismos necessitam de determinados nutrientes por forma a obter a energia necessário ao seu metabolismo celular; Enzimas – biomoléculas específicas, i.e.: proteínas, especializadas na catálise de reacções biológicas.

Abordagem Científica Especificamente na matriz cortiça, A estabilização pós-cozedura é etapa de maior actividade microbiológica na matriz cortiça; Os mecanismos, as espécies e as condições potenciadoras da formação de cloroanisóis na cortiça, encontram-se suficientemente estudadas; Durante a estabilização pós-cozedura, a combinação de diversos factores potenciam a formação de cloroanisóis como produtos intermediários de reacções biológicas; Desnaturação das enzimas – modificações físicas nas proteínas, resultando na perda da actividade biológica característica, i.e.: destruição da capacidade catalítica das enzimas

Abordagem Científica Como inibir a formação de cloroanisóis em cortiça ? Hipótese 1: Esterilização completa da cortiça, asseptização das instalações fabris e manuseamento da cortiça em condições de assepsia. ou Hipótese 2: Alteração das características do meio, possibilitando o desenvolvimento dos microorganismos “ benéficos” em condições controladas Desnaturação das enzimas – modificações físicas nas proteínas, resultando na perda da actividade biológica característica, i.e.: destruição da capacidade catalítica das enzimas

Abordagem Metodológica Hipótese 2: Alteração das características do meio-cortiça. Como? Actuar directamente na etapa de cozedura da cortiça. Enriquecimento da água com determinados aditivos, os quais, por difusão em meio aquoso fervente, irão fixar-se nas estruturas ricas em compostos lenhino-polissacáridos, nomeadamente paredes interiores dos canais lenticulares e raspa (ou costa) da cortiça. Desnaturação das enzimas – modificações físicas nas proteínas, resultando na perda da actividade biológica característica, i.e.: destruição da capacidade catalítica das enzimas

Abordagem Metodológica Planeou-se experiencias a nível laboratorial, na fase decozedura: Combinação de aditivos Cozimento aditivado Estabilização “forçada” Análise de cloroanisóis Aditivação eficaz? não Desnaturação das enzimas – modificações físicas nas proteínas, resultando na perda da actividade biológica característica, i.e.: destruição da capacidade catalítica das enzimas sim Escalonamento industrial

Resultados preliminares Costa Após várias combinações de aditivos… formulação X Determinação de 2,4,6-TCA em cortiça Obs: n.d. - não detectado; L.D.: 0,7 ng/l Superior Inferior Barriga Fracção Inferior Superior Mato n.d. 2,6 ng/l Cozedura normal e após ; estabilização “forçada” 31,0 ng/l 118,2 ng/l Cozedura com aditivos X; estabilização “forçada” 3,4 ng/l Desnaturação das enzimas – modificações físicas nas proteínas, resultando na perda da actividade biológica característica, i.e.: destruição da capacidade catalítica das enzimas

Resultados preliminares Costa ... (!?) ...repetição… Determinação de 2,4,6-TCA em cortiça Obs: n.d. - não detectado; L.D.: 0,7 ng/l Superior Inferior Barriga Fracção Inferior Superior Mato n.d. 2,6 ng/l Cozedura normal; estabilização “forçada” 12,2 ng/l 66,8 ng/l Cozedura com aditivos X; estabilização “forçada” Desnaturação das enzimas – modificações físicas nas proteínas, resultando na perda da actividade biológica característica, i.e.: destruição da capacidade catalítica das enzimas

Resultados preliminares Observação visual: Todos os provetes “aditivados” evidenciavam um acentuado desenvolvimento microbiano; Forma de fixação, desenvolvimento e esporulação das espécies? Preparação de meios de cultura microbiológica (WLN) com e sem aditivos X; Inoculação com espécies microbiológicas características da cortiça (espalhamento de solução de extracção de pedaços de cortiça); Incubação durante 5 dias a 27ºC; Seccionamento tangencial do meio de cultura; obtenção de perfis para análise de microscopia óptica. Ilustração do corte: Desnaturação das enzimas – modificações físicas nas proteínas, resultando na perda da actividade biológica característica, i.e.: destruição da capacidade catalítica das enzimas

Resultados preliminares Perfis tangenciais dos meios de cultura sem aditivação: Observação por microscopia óptica Desnaturação das enzimas – modificações físicas nas proteínas, resultando na perda da actividade biológica característica, i.e.: destruição da capacidade catalítica das enzimas

Resultados preliminares Perfis tangenciais dos meios de cultura sem aditivação: Observação por microscopia óptica Desnaturação das enzimas – modificações físicas nas proteínas, resultando na perda da actividade biológica característica, i.e.: destruição da capacidade catalítica das enzimas

Resultados preliminares Perfis tangenciais dos meios de cultura com aditivação: Observação por microscopia óptica Desnaturação das enzimas – modificações físicas nas proteínas, resultando na perda da actividade biológica característica, i.e.: destruição da capacidade catalítica das enzimas

Resultados preliminares Perfis tangenciais dos meios de cultura com aditivação: Observação por microscopia óptica Desnaturação das enzimas – modificações físicas nas proteínas, resultando na perda da actividade biológica característica, i.e.: destruição da capacidade catalítica das enzimas

Resultados preliminares Com a adição da formulação X… A actividade das espécies microbiológicas é marcadamente reduzida na matriz de suporte; Manutenção das características cromáticas e morfológicas do meio de cultura, indiciando que o efeito degradativo da acção enzimática foi francamente reduzido; Ausência de formas esporuladas no interior do meio de cultura. Desnaturação das enzimas – modificações físicas nas proteínas, resultando na perda da actividade biológica característica, i.e.: destruição da capacidade catalítica das enzimas

Resultados preliminares Com a adição da formulação X… Efeito barreira: Inexistência de hifas em profusão no interior do meio de cultura, indiciando que os microorganismos (bolores) se deparam com um meio interno “pouco atractivo”. Efeito simbiótico: Com a disponibilidade de nutrientes à superfície, os microorganismos tendem a fixar-se na interface, exibindo de forma “exuberante” a sua parte aérea visível (micélio exterior). Deste modo, a interface faculta um “terreno favorável” à disseminação dos microorganismos por dispersão superficial das suas formas esporuladas. Desnaturação das enzimas – modificações físicas nas proteínas, resultando na perda da actividade biológica característica, i.e.: destruição da capacidade catalítica das enzimas

Acção imediata Processo Symbios Escalonamento industrial (scale-up) - Avaliar a eficácia da formulação X em condições reais de utilização Processo Symbios Desnaturação das enzimas – modificações físicas nas proteínas, resultando na perda da actividade biológica característica, i.e.: destruição da capacidade catalítica das enzimas

Scale-up industrial Duas empresas rolheiras com processo industrial verticalizado: Sercor – Sociedade Exportadora de Rolhas e Cortiça, S.A. Norcor – Indústria de Cortiça, S.A. Início da experiência: Agosto de 2004; Lotes de cortiça de mato em processamento: campanha de 2003; Experiências realizadas numa base comparativa, i.e.: processo Symbios vs processo Tradicional. Desnaturação das enzimas – modificações físicas nas proteínas, resultando na perda da actividade biológica característica, i.e.: destruição da capacidade catalítica das enzimas

Scale-up industrial Experiências unidade piloto - aferição da concentração de aditivos Symbios Caracterização cortiça mato Cozedura Tradicional (PT): Água limpa, fervura 1 ½ hora 2 cozeduras consecutivas 1500 kg de cortiça /cozedura 12 000 litros de água Cozedura Symbios (PS): Água limpa, fervura 1 ½ hora 4 cozeduras consecutivas 1500 kg de cortiça/cozedura 12 000 litros de água + aditivos Symbios Avaliação qualitativa CTCOR Estabilização 2 a 4 semanas Avaliação qualitativa Empresas Desnaturação das enzimas – modificações físicas nas proteínas, resultando na perda da actividade biológica característica, i.e.: destruição da capacidade catalítica das enzimas Fabricação Acabamentos

Unidade piloto - Resultados Cozedura Symbios: Aumento notável da capacidade extractiva do meio de cozedura Cozedura tradicional; água limpa Cozedura Symbios; Desnaturação das enzimas – modificações físicas nas proteínas, resultando na perda da actividade biológica característica, i.e.: destruição da capacidade catalítica das enzimas

Unidade piloto - Resultados Cozedura Symbios: Aumento de eficácia na extracção de compostos polifenólicos Cozedura tradicional; água limpa Cozedura Symbios; Desnaturação das enzimas – modificações físicas nas proteínas, resultando na perda da actividade biológica característica, i.e.: destruição da capacidade catalítica das enzimas

Unidade piloto - Resultados Cozedura Symbios: Aumento de eficácia na extracção de compostos polifenólicos Cozedura tradicional; água limpa Cozedura Symbios; água limpa Desnaturação das enzimas – modificações físicas nas proteínas, resultando na perda da actividade biológica característica, i.e.: destruição da capacidade catalítica das enzimas Cozedura Symbios; cozeduras consecutivas

Experiência industrial - Resultados Estabilização pós cozedura: Tal como expectável, registou-se um elevado desenvolvimento micológico nas pranchas submetidas ao processo Symbios. Clara dominância de espécies dos géneros Monilia s.p. e Mucor s.p. Desnaturação das enzimas – modificações físicas nas proteínas, resultando na perda da actividade biológica característica, i.e.: destruição da capacidade catalítica das enzimas

Experiência industrial - Resultados Desenvolvimento microbiológico durante a estabilização pós cozedura: Processo Tradicional vs Processo Symbios Desnaturação das enzimas – modificações físicas nas proteínas, resultando na perda da actividade biológica característica, i.e.: destruição da capacidade catalítica das enzimas Processo Tradicional Processo Symbios

Experiência industrial - Resultados Desenvolvimento microbiológico durante a estabilização pós cozedura: Processo Tradicional vs Processo Symbios Desnaturação das enzimas – modificações físicas nas proteínas, resultando na perda da actividade biológica característica, i.e.: destruição da capacidade catalítica das enzimas Processo Tradicional

Experiência industrial - Resultados Desenvolvimento microbiológico durante a estabilização pós cozedura: Processo Tradicional vs Processo Symbios Desnaturação das enzimas – modificações físicas nas proteínas, resultando na perda da actividade biológica característica, i.e.: destruição da capacidade catalítica das enzimas Processo Symbios

Experiência industrial - Resultados Desenvolvimento micológico durante a estabilização pós cozedura: Processo Tradicional (PT) vs Processo Symbios (PS) Actividade de fungos filamentosos Potencial de síntese da micotoxina OTA? Determinação da Ocratoxina A (OTA) nas pranchas de cortiça pós-estabilização (Ensaios realizados pelo Centro de Engenharia Biológica da Universidade do Minho) Restrições regulamentares Amostra OTA (mgOTA/kg cortiça) PT 0,376 PS 0,294 Desnaturação das enzimas – modificações físicas nas proteínas, resultando na perda da actividade biológica característica, i.e.: destruição da capacidade catalítica das enzimas

Experiência industrial - Resultados Determinação da Ocratoxina A (OTA) nas pranchas de cortiça pós-estabilização (Ensaios realizados pelo Centro de Engenharia Biológica da Universidade do Minho) Avaliação dos resultados: Resultados idênticos entre as amostras PT e PS Com base no limite proposto para o vinho de 2mg/L (…) (…) assumindo que cada rolha pesa cerca de 3,5 g (…) (…) assumindo que toda a OTA de uma rolha passa para o vinho (!!!) (…) A concentração final no vinho seria de  0,0016 mg/l O que representa 0,08 % (!!!) do limite máximo admissível proposto para o vinho Desnaturação das enzimas – modificações físicas nas proteínas, resultando na perda da actividade biológica característica, i.e.: destruição da capacidade catalítica das enzimas

Experiência industrial - Resultados Determinação de 2,4,6-TCA (libertável) nas rabanadas de cortiça Costa Amostras PT (ng/l) Costa 22,6 56,6 29,7 113,1 Amostras PS (ng/l) Costa 2,4 4,8 9,7 5,4 Desnaturação das enzimas – modificações físicas nas proteínas, resultando na perda da actividade biológica característica, i.e.: destruição da capacidade catalítica das enzimas

Experiência industrial - Resultados Determinação de 2,4,6-TCA (libertável) nas rabanadas de cortiça Sub-costa Amostras PT (ng/l) Sub -costa 1,8 4,1 3,1 2,8 Amostras PS (ng/l) Sub -costa n.d. n.q. Desnaturação das enzimas – modificações físicas nas proteínas, resultando na perda da actividade biológica característica, i.e.: destruição da capacidade catalítica das enzimas LD: 0,7 ng/l; LQ: 1,4 ng/l

Experiência industrial - Resultados Análise sensorial de rolhas lavadas: Nas amostras procedentes de ambas as empresas verificou-se que: A incidência de “mofo” nas referências PS é vestigiária (menor que 1/1000) e, quando ocorre, dá-se a níveis de intensidade “ligeiro”; Nas amostras PT registou-se a ocorrência de “mofo” em 1 a 2% das rolhas analisadas, com níveis de intensidade “ligeiro” a “forte”; “As amostras PS evidenciam um abaixamento notável da linha de base (i.e.: aumento da limpidez sensorial), quando comparadas com as referências PT”: “As amostras PS evidenciam uma menor variabilidade da linha de base, quando comparadas com as referências PT”. Desnaturação das enzimas – modificações físicas nas proteínas, resultando na perda da actividade biológica característica, i.e.: destruição da capacidade catalítica das enzimas

Experiência industrial - Resultados Análise sensorial de rolhas lavadas Simulador de contacto: água destilada/desodorizada (Nota: Amostras PT e PS de uma única empresa) Confirmação analítica Quantificação de cloroanisóis “libertáveis” na rolha individual 29,1 ng /l 4,0 ng/l 8,9 ng/l 1,5 ng/l 28,4 ng /l 66,4 ng/l 5,0 ng/l 15,0 ng/l 21,2 ng/l 9,7 ng /l 75,8 ng/l 6,2 ng/l Amostras PT (ng/l) Ausência de “mofo” 893 Detecção de “mofo” 12 Total de rolhas 905 2,4,6-TCA Desnaturação das enzimas – modificações físicas nas proteínas, resultando na perda da actividade biológica característica, i.e.: destruição da capacidade catalítica das enzimas Admitindo que a rolha cederia todo o TCA libertável (?!) Limite de detecção sensorial em vinho: 4 ng/l Taxa de incidência de “mofo” = 11/905 rolhas = 1,2%

Experiência industrial - Resultados Análise sensorial de rolhas lavadas Simulador de contacto: água destilada/desodorizada (Nota: Amostras PT e PS de uma única empresa) Confirmação analítica Quantificação de cloroanisóis “libertáveis” na rolha individual Amostras PS (ng/l) Ausência de “mofo” 1181 Detecção de “mofo” 3 Total de rolhas 1184 1,9 ng /l 1,6 ng/l 6,6 ng/l 2,4,6-TCA Admitindo que a rolha cederia todo o TCA libertável (?!) Desnaturação das enzimas – modificações físicas nas proteínas, resultando na perda da actividade biológica característica, i.e.: destruição da capacidade catalítica das enzimas Limite de detecção sensorial em vinho: 4 ng/l Taxa de incidência de “mofo” = 1/1184 rolhas = 0,08% (!!!)

Experiência industrial - Resultados Determinação de 2,4,6-TCA (libertável) em triturados de aparas de broca; Tempo de stockagem das aparas: 2 meses Amostras PT (ng/l) 83,5 55,8 217,7 Amostras PS (ng/l) 8,8 18,1 2,7 Desnaturação das enzimas – modificações físicas nas proteínas, resultando na perda da actividade biológica característica, i.e.: destruição da capacidade catalítica das enzimas

Experiência industrial - Resultados Comportamento físico-mecânico das rolhas de cortiça: Massa volúmica; Compressão e Relaxação Desnaturação das enzimas – modificações físicas nas proteínas, resultando na perda da actividade biológica característica, i.e.: destruição da capacidade catalítica das enzimas Legenda: PT1 PT2 PS1 PS2

Conclusões O processo Symbios é um processo biológico, de cariz preventivo, que promove o desenvolvimento de microorganismos “benignos”, em detrimento de espécies com potencial de formação de metabolitos indesejados; O processo Symbios promove a inibição da biosíntese de cloroanisóis durante a etapa de preparação da cortiça; A cozedura Symbios assegura uma maior limpeza e extracção de matérias hidrossolúveis da cortiça (ex.: terras, polifenóis, etc.); Desnaturação das enzimas – modificações físicas nas proteínas, resultando na perda da actividade biológica característica, i.e.: destruição da capacidade catalítica das enzimas

Conclusões Com a obtenção de aparas “mais limpas” (física e organolépticamente), as vantagens do processo Symbios são repercutidas ao longo da cadeia de fabricação de rolhas técnicas; O processo Symbios é inócuo e respeita as regulamentações comunitárias de materiais destinados a contacto com géneros alimentícios; O processo Symbios não introduz quaisquer alterações às características físico-mecânicas da cortiça, salvaguardando a funcionalidade do produto - rolha de cortiça. Desnaturação das enzimas – modificações físicas nas proteínas, resultando na perda da actividade biológica característica, i.e.: destruição da capacidade catalítica das enzimas

Condições p/ implementação Implementação na fase da cozedura Cumprimento do Código Internacional das práticas rolheiras: separação de calços e manchas amarela Resultados optimizados com cortiça do mato

“The Knowledge of nature” Processo Symbios “The Knowledge of nature” Desnaturação das enzimas – modificações físicas nas proteínas, resultando na perda da actividade biológica característica, i.e.: destruição da capacidade catalítica das enzimas

Muito Obrigado pela Vossa Atenção Desnaturação das enzimas – modificações físicas nas proteínas, resultando na perda da actividade biológica característica, i.e.: destruição da capacidade catalítica das enzimas