BCM13042 Fundamentos de Análises de Proteínas Docentes Célia R Carlini Charley C. Staats Diogo R Demartini Hugo Verli Súmula Aminoácidos e peptídeos: estrutura; estereoquímica; propriedades físico-químicas; curva de titulação; ponto isoelétrico; ligação peptídica Proteínas: arquitetura de proteínas; tipos de estrutura secundária; enovelamento; modificações pós-traducionais; mobilidade eletroforética; flexibilidade; catálise Métodos para determinação da estrutura de proteínas: RMN; cristalografia de raios-X; Dicroísmo circular Espectometria de massas: metodologias de ionização; metodologias de análise. Métodos para determinação da quantidade de proteínas: gravimétrico; absorbância; fluorescência; ninhidrina; biureto; lowry; azul de comassie; acido bicinchônico. Métodos de separação, purificação se sequenciamento de proteínas, peptídeos e aminoácidos: precipitação; salting in; salting out; eletroforese; cromatografia liquida, ultracentrifugação; química de Edman; métodos de separação de aminoácidos.

BCM13042 Fundamentos de Análises de Proteínas 22/11 Aminoácidos e peptídeos: Charley 23/11 Estrutura e determinação da estrutura de proteínas: Hugo 24/11 Métodos de quantificação, análise e purificação de proteínas: Célia 25/11 Espectrometria de massas e proteômica 29/11 – 02/12 Seminários 1 tópico por dia 5 grupos por tópico

Tópico 1 – Métodos de Análise e Caracterização de Peptídeos Papéis Biológicos de D-Aminoácidos Determinação de sequencia de aminoácidos/peptídeos (Edman, MS-MS, Dansylação) Assinalamento de padrões (bioinformática) Modificações pós-traducionais: tipos, funções e impactos em análises Síntese de peptídeos para avaliação biológica Tópico 2 – Métodos de Análise e Caracterização de Peptídeos Eletroforeses (1D, 2D, nativa, zimogramas) Cromatografia (troca iônica, hidrofóbica, fase reversa, afinidade) Metodologias de quantificação de proteínas Precipitação fracionada Métodos Imunoquímicos Tópico 3 – Espectrometria de massas e proteômica MudPit / GELC – MS Proteômica quantitativa comparativa Metaloproteômica Fosfoproteômica Interatoma Tópico 4 – Determinação de estrutura RMN Dicroísmo circular Fluorometria Cristalografia – Raios X Determinação de motivos estruturais

BCM13042 Fundamentos de Análises de Proteínas Avaliação Apresentação de 1 item referente a cada tópico Respostas aos questionários aplicados pelos colegas Cada aluno deverá formular 1 questão sobre o item apresentado Os demais alunos deverão escolher 2 questões referentes a cada tópico para responder As questões devem ser embasadas em um artigo científico. Espera-se que a questão seja formulada a partir de um gráfico ou tabela presente no artigo científico. O autor da questão será responsável pela correção. Aulas serão disponibilizadas junto ao endereço www.ufrgs.br/laprotox

Sorteio

Amino-Ácidos

Estrutura geral dos Aminoácidos

Quantos aminoácidos existem em sistemas biológicos?

20 aminoácidos definidos por seu códon no mRNA Grupo R 5 grupos distintos 2 aminoácidos não usuais Inserção depende de um elemento cis no mRNA

Polar - aquoso Apolar - lipídico Polar - aquoso

Selenocystein Pyrrolysine

Hypothetical scheme for the cotranslational insertion of pyrrolysine in response to a context-dependent UAG codon. Hypothetical scheme for the cotranslational insertion of pyrrolysine in response to a context-dependent UAG codon. tRNAPyl (anticodon CUA) is either first aminoacylated with lysine, and subsequently modified to generate Pyl-tRNAPyl, or alternatively Pyl-tRNAPyl is directly synthesized by an unknown route. Pyl-tRNAPyl would then bind the SelB-like elongation factor EF-Pyl (see text for details of candidate EF-Pyl proteins). The Pyl-tRNAPyl:EF-Pyl complex would associate with the pyrrolysine insertion sequence (PYLIS) via a putative PYLIS binding protein (PBP), thereby directing delivery of Pyl-tRNAPyl to the ribosomal A site when the decoding site is occupied by the corresponding UAG. Ibba M , Söll D Genes Dev. 2004;18:731-738 ©2004 by Cold Spring Harbor Laboratory Press

Formação de pontes de enxofre

Estereoisomeros a-carbon is a chiral center Two stereoisomers are called enantiomers. The solid wedge-shaped bonds project out of the plane of paper, the dashed bonds behind it. The horizontal bonds project out of the plane of paper, the vertical bonds behind.

The Stereochemistry of Amino Acids http://www.imb-jena.de/~rake/Bioinformatics_WEB/gifs/amino_acids_chiral.gif

D-aminoácidos existem e são metabolizados

Serine-racemase

D-amino ácidos em proteínas?

Características físico-químicas dos aminoácidos

Absorbância na região UV de aminoácidos aromáticos

Estudos conformacionais – Try fluorescence Changes in low density lipoprotein receptor intrinsic tryptophan fluorescence upon calcium addition. Changes in intrinsic tryptophan fluorescence upon calcium addition. The fluorescence emission of tryptophan residues in LDL-R354 was measured from 300 to 400 nm at 1-nm increments after excitation at 280 nm. Fluorescence intensity measurements are expressed in arbitrary units as the ratio of channel A (sample channel) to channel B (reference channel). Each sample contained 7.4 μg of protein in 10 mm Tris, 60 mm KCl, pH 7.4. (Squares, 100 μm free Ca2+; circles, 100 μm EDTA; closed symbols, 7.4 μg LDL-R354; open symbols, buffer alone [no protein]). Dirlam-Schatz K A , Attie A D J. Lipid Res. 1998;39:402-411 ©1998 by American Society for Biochemistry and Molecular Biology

Zwitterion = íon híbrido

Voet Biochemistry 3e © 2004 John Wiley & Sons, Inc.

Efeito sobre o pKa do ambiente químico

Henderson/Hasselbach equation and pKa Protonated form Unprotonated form (conjugate base) HA ↔ H+ + A- Ka = [H+] [A-] / [HA] [H+] = Ka [HA]/ [A-] -log [H+] = -log (Ka [HA]/ [A-]) -log [H+] = -log Ka -log ([HA]/ [A-]) pH = p Ka - log ([HA]/ [A-])

Titulação de um aminoácido

Curva de titulação Glutamato

Curva de titulação> Histidina Anel indólico

Peptídeos

Formação da ligação peptídica

Níveis estruturais das proteínas

Como se definem estruturas secundárias?

Distâncias interatômicas na ligação peptídicas são menores que as de uma ligação amida comum Ressonância eletrônica Ligação peptídica tem 50% de carácter de dupla ligação rígida e coplanar

Ângulos de rotação da cadeia polipeptítica em torno de um carbono alfa Cadeias laterais

A B C D E F Gráfico de Ramachandran

O que é um domínio protéico?

Procura de domínios conservados

Localização da proteína pode trazer informações sobre a sua função