BIOLOGIA MOLECULAR

HISTORICO 1800 1900 1950 1600 Princípio transformante Griffiths, 1928 Fundação da genética (Mendel, 1866) e da evolução (Darwin, 1859) Fatores e fermentos Garrod e Bateson, 1909 Descoberta do microscópio Dupla Hélice Watson e Crick, 1953 Células, organelas Nucleína (Miecher, 1869) Cromatina (Flemming,1879) DNA:depositário Avery, 1944 Divisão Celular Sutton e Boveri, 1902 Genes e enzimas Beadle e Tatum, 1940

O princípio transformante: Griffiths, F. 1928 Cepa rugosa (L) Camundongo sobrevive Cepa Lisa (L) Camundongo morre Cepa Lisa (L) inativada pelo calor Cepa rugosa (L) viva + Camundongo morre Camundongo sobrevive Cepa Lisa (L) inativada pelo calor

O princípio transformante: Avery O. 1944 proteínas RNA Cepa Lisa (L) inativada pelo calor Cepa rugosa (L) viva polissacarídeos Camundongo sobrevive lipídeos Cepa rugosa (L) viva DNA Camundongo morre O DNA é o depositário da informação genética

Neel, Beet, Pauling, e Ingram e a anemia falciforme, 1941-57

Identificar e caracterizar genes: O problema dos bioquímicos Identificar e caracterizar genes: a busca do gene perdido

Experimentos que levaram ao modelo da dupla hélice Alexander Todd descreve que o DNA é um polinucleotídeo

Experimentos que levaram ao modelo da dupla hélice a-hélice é descrita como a estrutura das proteínas Rosalind Franklin faz experimentos de difração de Raios-X que são “mostrados” a Watson Esses experimentos sugerem uma estrutura magricela e helicóide, com duas fitas e um diâmetro com pirimidinas e purinas pareando

Experimentos que levaram ao modelo da dupla hélice Erwin Chargaff se encontra com Watson e Crick e relata seus achados: as quantidades relativas de A e T são iguais e C e G também.

Resumo: DNA

Resumo: DNA

Evolução do conhecimento em biologia molecular desde a dupla-hélice PCR,1985 Transgênicos, 1980 Primeiro gene humano,1977 Enzimas de restrição,1971 Insulina recombinante,1982 Sequencimento de DNA, 1975 DNA recombinante, 1973 Genômica, 1991 Bancos de armazenamento de dados 1971 Replicação, 1958 DNA polimerase, 1961 Hibridização por Sothern,1975 Código genético, 1961 Regulação da expressão gênica,1961 Retrotranscrição, 1970 Transcrição 1957 Dupla-hélice, 1953 1950 1960 1970 1980 1990

Como nós podemos manipular o DNA? 1a etapa: purificação

Como nós podemos manipular o DNA? 2a etapa: visualização

Como nós podemos manipular o DNA? 2a etapa: visualização: eletroforese em gel

Como nós podemos manipular o DNA? 3a etapa: cortar e colar GAATTC GGGCCC CTTAAG CCCGGG Enzimas de restrição: tesouras moleculares

Criação de moléculas recombinantes DNA Estranho Fragmentos do DNA estranho “insert” Plasmídio aberto, Gene resistente à Ampicillina Plasmídio circular, com “Insert” Mistura com aenzima Ligase L I G A T O N

Como clonar um gene? isolar o DNA - digerir com enzimas de restrição - digerir os plasmídeos com a mesma enzima - ligar as fitas de DNA e plasmidiais

Como clonar um gene? Introduzir os plasmídeos recombinantes nas bactérias - selecionar os plasmídeos

CLONAGEM DA INSULINA Insulina recombinante (Humulin) -introduzir gene responsável pela produção de insulina dos seres humanos em bactérias (plasmídios) -bactérias produzem insulina humana recombinante -produção praticamente ilimitada e com custos muito baixos em comparação ao outro método

luminescente de bactéria Transgênicos Primeiro mamífero transgênico: hormônio do crescimento Tabaco com gene luminescente de bactéria Transgênico que reverteu o sexo

Identificação humana: teste de paternidade por DNA Complementaridade pode ser usada para se fazer uma “pescaria molecular”

Hibridização por Southern 1. Separação do DNA fragmentado por eletroforese em gel 2. Transferência do DNA fragmentado para um suporte sólido (filtro de Nitrocelulose) 3. Hibridização com a sonda marcada Pólo negativo - - - - - - - - - - - - - - Poços + + + + + + + + + + 4. Lavagem do filtro para manter apenas a sonda hibridizada com o fragmento de DNA especifico 5. Exposição a um filme de Raios-X

Teste de Paternidade

Paternidade Inclusão Exclusão

O que mudou na era genômica/Pós-genômica? ...escala! No de genes estudados

Abordagem “ômica” de doenças complexas Sistemas automatizados Biomatemática Bioinformática Bioestatística Larga-escala Melhores ferramentas Vacinas Testes genéticos Remédios

DNA RNA PTN genoma transcriptoma proteoma Reinvenção do dogma central da biologia molecular? DNA RNA PTN genoma transcriptoma proteoma

Projeto genoma: santo Graal DNA na sociedade DNA Trangênicos Drogas recombinantes: insulina, vacina HBV Medicamentos inteligentes (dosagens pessoais) Diagnóstico de doenças Teste de Paternidade Projeto genoma: santo Graal Árvore da vida Código da vida Manual de informações Livro de receitas

Informações sobre 751 notícias em 5 jornais diários brasileiros Quando o DNA vira notícia (Massarani et al, C&A:26, 2003) Informações sobre 751 notícias em 5 jornais diários brasileiros Jun/2000- mai/2001 Distribuição dos artigos por assunto Mapeamento genético 78% Associação entre genes e doenças e comportamento 30% Trangênicos 23,7% Clonagem 13,7% Atitude da imprensa Postura favorável 54% favorável com ressalvas 5% Postura desfavorável 15,7% prós e contras 30,1%

A ideologia do DNA no século XX Década de 20: hereditariedade e, em última análise, os (desconhecidos) genes definem as características do indivíduo das morfológicas as comportamentais. Década de 60: dogma central após o modelo da dupla-hélice cria a idéia do DNA como um plano mestre da execução da vida Década de 90: Genoma, aos invés do DNA apenas, reconstitui a o conceito de entendimento da planta dos seres vivos (blueprint)