Cultura de Tecidos Vegetais RODRIGO ROCHA LATADO

CULTURA DE TECIDOS VEGETAIS INFRAESTRUTURA Área de Preparo de Meios de Cultura - água: destilador e deionizador, osmose reversa ultra purificação - balanças: analítica ou eletrônica (g até Kg) e (mg até g) - agitador magnético, com aquecimento - distribuidor de meio de cultivo - pHmetro - drogas (sais) - vidrarias 2

Área de Esterilização e Lavagem de Vidraria INFRAESTRUTURA Área de Esterilização e Lavagem de Vidraria - autoclave - estufa para secagem - estufa para esterilização - máquina de lavar vidraria 3

Área de Manipulação e Exame das Culturas INFRAESTRUTURA Área de Manipulação e Exame das Culturas - Capela (câmara) de fluxo laminar - Microscópios: comum, invertido (com fluorescência) (câmara fotográfica ou acoplamento a vídeo) - Material para manipulação (pinças, bisturis, espátulas, etc...) - Lupa - Centrífuga - Eletroporador 4

Câmara de fluxo laminar vertical INFRAESTRUTURA Câmara de fluxo laminar vertical 5

Câmara de fluxo laminar horizontal INFRAESTRUTURA Câmara de fluxo laminar horizontal 6

Área de Aclimatização das Plantas INFRAESTRUTURA Área de Incubação das Culturas - sala com luz e temperatura, controladas - incubadora - agitador orbital (Shaker) Área de Aclimatização das Plantas - câmara úmida - casa-de-vegetação - telado 7

Desenvolvimento de Segmentos de Tecidos ou Órgãos Isolados MEIOS NUTRITIVOS Desenvolvimento de Plantas Inteiras - nutrientes minerais (solo, água) - CO2 - Cfixado + minerais: síntese de vitaminas e hormônios - síntese de compostos orgânicos ocorre em diferentes órgãos Desenvolvimento de Segmentos de Tecidos ou Órgãos Isolados Cultivo in vitro - condições inadequadas de iluminação e CO2 - plantas não são completamente autotróficas - explantes com baixo teor ou ausência de clorofila - necessidade de fornecer compostos orgânicos 8

MEIOS NUTRITIVOS Meio Nutritivo ou Meio de Cultura - fornecer substâncias essenciais para o crescimento - permitir que os explantes se desenvolvam em ambiente artificial - baseados nas exigências das plantas inteiras em sais minerais - suplementados com componentes orgânicos - controlam o padrão de desenvolvimento in vitro 9

MEIOS NUTRITIVOS - primeiros trabalhos: soluções inorgânicas simples HISTÓRICO - primeiros trabalhos: soluções inorgânicas simples solução de Knop (1865) solução de Knudson (1925) solução de Hoagland & Arnon (1938) - atualmente: meios de cultura mais completos White (White, 1943) MS (Murashige & Skoog, 1962) B5 (Gamborg et al., 1968) KM (Kao & Michayluk, 1975) WPM 10

ÁGUA - Métodos de Purificação Água grau primário - alto índice de impurezas - alta condutividade - utilizada para lavar vidraria Água grau de laboratório - alto índice de pureza - baixo nível de orgânicos e microorganismos - utilizada no preparo de meios de cultura (microbiologia) Água ultrapura (tipo 1) - estádio posterior à destilação e deionização - alta resistividade, baixo nível de orgânicos e microorganismos - utilizada em técnicas analíticas (HPLC, eletroforese capilar) - utilizada em biologia molecular

MÉTODOS DE PURIFICAÇÃO DE ÁGUA Destilação: aquecer – ferver – evaporar a água condensar o vapor e coletar alto consumo de energia (1KW/litro) alto consumo de água (30l/litro) resistividade 1M-cm não elimina CO2, amônia e voláteis processo lento Deionização: resina de troca iônica H+ cátions OH- ánions processo contínuo resistividade 18M-cm não elimina orgânicos

MÉTODOS DE PURIFICAÇÃO DE ÁGUA Osmose Reversa: pressão > pressão osmótica 90-98% íons orgânicos 100% contaminantes não iônicos moléculas orgânicas PM >100 não remove gases normalmente associado a resina de troca iônica Adsorção por Carvão Ativado remove cloro, orgânicos dissolvidos instalado antes do equipamento de purificação Filtração em Microporo: filtro de 0.22m elimina bactérias e esporos de fungos

MEIOS NUTRITIVOS Componentes Inorgânicos macronutrientes micronutrientes Componentes Orgânicos vitaminas fonte de C reguladores vegetais outros: mio-inositol aminoácidos antioxidantes substâncias complexas carvão ativado 14

COMPONENTES INORGÂNICOS MEIOS NUTRITIVOS COMPONENTES INORGÂNICOS MACRONUTRIENTES Nitrogênio: NH4NO3 e KNO3 Fósforo: KH2PO4 ou K2HPO4 Potássio: KH2PO4 e KI Cálcio: CaCl2*2H2O Magnésio: MgSO4*7H2O Enxofre: MgSO4*7H2O, MnSO4*H2O, ZnSO4*7H2O, CuSO4*H2O e FeSO4*7H2O 15

MEIOS NUTRITIVOS COMPONENTES INORGÂNICOS MACRONUTRIENTES Nitrogênio: participa do desenvolvimento geral das plantas NO3-: nitrato [25 - 40mM] Norg: aminoácidos NH4+: amônia [2 - 20mM] ác. orgânicos Total de N: [25 - 60mM] caseína hidrolisada Fósforo: parte integrante de ác. nucléicos e compostos estruturais PO4-: [1 - 3mM] Fosfato de sódio ou de potássio Ninorg aminoácidos proteínas

Potássio: atividades de membrana, controle da osmolaridade MACRONUTRIENTES Potássio: atividades de membrana, controle da osmolaridade K+ : [20 - 30mM] acompanha nitratos e fosfatos Cálcio: cofator de enzimas, síntese da parede celular Ca+2: [1 - 3mM] cloreto ou nitrato de cálcio Magnésio: integrante da clorofila, atividade de enzimas Mg+2 : [1 - 3mM] sulfato de magnésio Enxofre: estrutura das proteínas, presente em aminoácidos SO4-2 : [1 - 3 mM] sulfato de magnésio

MICRONUTRIENTES Boro: atividade enzimática, biossíntese de lignina ácido bórico: [100mM] Cobalto: cloreto de cobalto: [0.1mM] Cobre: atividade enzimática sulfato de cobre: [0.1mM] Iodo: iodeto de potássio [5mM] Ferro: síntese de clorofila, reações de oxi-redução presente na forma de quelato (EDTA) sulfato de ferro: [100mM]

MICRONUTRIENTES Manganês: atividade enzimática (respiração e fotossíntese) sulfato de manganês: [30 - 100mM] Molibdênio: cofator de enzimas molibdato de sódio: [1mM] Zinco: atividade enzimática sulfato de zinco: [5 - 30mM]

COMPONENTES ORGÂNICOS - Fontes de C: sacarose [2 - 5%] hidrolisado em glicose + frutose glicose manitol, maltose, outros - Vitaminas: (mg/l) tiamina: essencial (metabolismo de carboidratos e biossíntese de aminoácidos) ác. nicotínico piridoxina - Outros: mio-inositol: carbohidrato (desenvolvimento de membranas e parede celular)

- Substâncias Complexas: água de coco extrato de levedura extrato de malte caseína hidrolisada - Antioxidantes: ácido ascórbico PVP (adsorção de fenóis) ácido cítrico - Carvão Ativado: [0.2 - 3.0%] - adsorção fenóis liberados no meio de cultura - adsorção de componentes orgânicos (auxinas, citocininas) - contribui com o desenvolvimento de raízes

HORMÔNIOS / REGULADORES DE CRESCIMENTO - essenciais, pois direcionam o processo morfogenético em cultura de tecidos vegetais ( 1 M até 40 M) Auxinas: primeiro hormônio vegetal identificado (AIA) associadas a sítios de alta divisão celular in vivo: alongamento de células dominância apical formação de raiz adventícia in vitro: divisão celular, associada a citocinina formação de calo diferenciação de raízes inibe desenvolvimento de gemas laterais indução de embriogênese somática

COMPONENTES ORGÂNICOS Auxinas auxina natural: IAA - ácido 3-indol acético IBA - ácido 3-indol butírico auxina sintética: NAA - ácido naftaleno acético 2,4-D - ácido 2,4-diclorofenoxi acético 2,4,5-T - ácido 2,4,5-triclorofenoxi acético substitutos de auxina: picloram, dicamba - alta concentração são herbicidas - in vitro atividade de auxina inibidores da síntese de auxina: HNB - 5-hidroxi-nitrobenzil bromide 7-AZA - 7-azaindole inibidores do transporte de auxina: TIBA - ácido 2,3,5-triiodobenzóico PCIB - acido isobutírico clorofenoxi acético NPA - ácido naftilphthalamico

COMPONENTES ORGÂNICOS Citocininas - dominância apical (indução de brotações múltiplas) - balanço citocinina/auxina - divisão celular citocinina natural: zeatina 2iP - 2-isopentenil adenina citocinina sintética: BAP - 6-benzilaminopurina cinetina derivados de feniluréia: TDZ – thidiazuron atividade de citocinina in vitro estimula síntese de citocinina natural

COMPONENTES ORGÂNICOS Giberelinas: isolada do fungo Gibberella fujikoroi relacionada com alongamento (altura) das plantas ácido giberélico (GA3) in vitro: inibe organogênese inibe enraizamento estimula alongamento de brotos Ácido Abscísico: relacionado com a dormência de sementes e gemas relacionado com a senescência, abscisão de folhas in vitro: diminui o crescimento modera efeito de auxina/citocinina regula desenvolvimento de embriões somáticos

AGENTES GELIFICANTES polissacarídeos, que servem como suporte as plantas ou explantes. ágar-ágar produzido pela alga (Gelidium amansii) sofre hidrólise, quando autoclavado em meio ácido Gelrite (Merck) produzido pela bactéria (Pseudomonas elodea) usado em menor quantidade (2,5 g/L) mais transparente Phytagel (Sigma) usado em menor quantidade (3,0 g/L)

AGENTES GELIFICANTES Agarose purificado a partir do ágar Mais puro, porém muito mais caro vários tipos (diferentes pontos de solidificação) -Agentes gelificantes podem podem induzir a hiperhidricidade (vitrificação) dos brotos ou plantas cultivadas in vitro. Hiperhidricidade ou vitrificação - anomalia do tecido, na qual este fica rígido e quebradiço, havendo mal formação dos estômatos na plântula e dificuldade de enraizar.

PREPARO DE MEIOS DE CULTURA PROCEDIMENTOS E CUIDADOS - dissolver sais em água pura - dissolver auxinas em KOH+ água pura e estéril - dissolver citocininas em HCl + água pura e estéril - não misturar produtos que podem precipitar - armazenar soluções de sais e vitaminas em geladeira - armazenar reguladores de crescimento em freezer - antes do uso, verificar se não há contaminação ou precipitação

PREPARO DE MEIOS DE CULTURA UNIDADES DE CONCENTRAÇÃO - Porcentagem de volume (% v/v): exemplo: 5% de água de coco = 50ml água coco + 950ml água - Porcentagem de peso (% p/v): exemplo: 2% de sacarose = 20g de sacarose em 1000ml - Molar (M): peso molecular (g/L) ex. PM do AIA=175,18g 1M de AIA= 175,18g/L

UNIDADES DE CONCENTRAÇÃO - Milimolar (mM): 1 M = 1.000 mM 1 mM = 1/1000M = 0,001M = 10-3 M ex. PM do AIA=175,18g logo 1M de AIA= 175,18g/L 1 mM AIA = ?? como 1mM = 1/1000 M 1 mM = 0,1758 g/L = 175,18 mg/L de AIA

UNIDADES DE CONCENTRAÇÃO - Micromolar ( M): 1 M = 1.000.000  M 1  M = 1/1.000.000 M = 10-6 M ex. PM do AIA=175,18g logo 1M de AIA= 175,18g/L 1  M AIA = ?? como 1  M = 1/1.000.000 M 1 mM = 0,1758 g/L ou 175,18 mg/L de AIA 1  M = 0,0001758 g/L ou 0,17518 mg/L de AIA

UNIDADES DE CONCENTRAÇÃO - mg/L ex. reguladores de crescimento - Ppm: partes por milhão = mg/L 1 ppm = 1 parte em 1.000.000 partes 1 L água pura pesa 1 Kg 1 mL pesa 1 g 1 L pesa 1 mg logo 1 ppm = 1 mg em 1 Kg (mg/K) ou 1 L em 1 L (L/L) ou 1 mg em 1 L (mg/L)

esterilizar (filtração ou autoclavagem) MEIO DE CULTURA MS (Murashige & Skoog, 1962) Meio líquido ajustar o pH 5,8 a 6,0 esterilizar (filtração ou autoclavagem) Meio semi-sólido ou sólido acrescentar agente gelificante (Phytagel, ágar)

ASSEPSIA E ESTERILIZAÇÃO Assepsia - Conjunto de procedimentos para tornar um explante livre de microorganismos (bactérias, fungos filamentosos, leveduras, etc...). Contaminação: crescimento de microorganismos (fungo e/ou bactéria) no meio de cultura. Fontes: explante meio de cultura meio ambiente (área de trabalho/materiais) operador Explantes: obtidos de plantas cultivadas no campo, em estufas ou in vitro.

ASSEPSIA E ESTERILIZAÇÃO Assepsia: folhas, sementes, gemas, etc...) - lavar em água corrente com detergente - lavar em água corrente - banho em álcool 70% - hipoclorito de sódio (3:1) + gotas de tween - agitar 15 - 20 min. - na câmara asséptica, lavar com água esterilizada (3x) Meios de Cultura - Autoclave: calor úmido (121o C/ 15 - 20min.) - Filtração: produtos sensíveis à temperatura (membrana 0,22m)

ASSEPSIA E ESTERILIZAÇÃO Área de Trabalho/Materiais - Esterilização de Vidraria e Material: calor seco (estufa: 140 - 180o C/ 2 a 4h.) calor úmido (autoclave) + secagem (estufa) raios-gama: plásticos descartáveis Flambagem das pinças e bisturis durante o trabalho - Limpeza Laboratório e Vidraria álcool: balcão e capela detergente + H2O destilada: vidraria desinfetante: chão