Práticas microbiológicas Escherichia coli “O que vale para E. coli vale para elefantes” Jacques Lucien Monod (1910 –1976) Práticas microbiológicas
Escherichia coli -Presente no intestino -Caracterizada em 1855 pelo Dr Theodor Escherich Cepa O157:H7 patogênica a humanos Cepa K-12 comensal Auxilio nos estudos pioneiros da biologia molecular 100 mil publicações (Lederberg, 2004)
Escherichia coli Unicelular na forma de bastão Cresce rapidamente a 37oC ciclo de 20 min Pouco exigente nutricionalmente Meio mínimo ou rico Glicose - melhor fonte de C Extrato de levedura - essenciais Triptona e Peptona: fonte aminoácidos
Escherichia coli Todas cepas derivam da K-12 Denominação Nome do Laboratório e números representam sequencia de obtenção da cepa Cepas mais utilizadas (DH10, BL21, JM 109, HB 101, DH5a, XL blue,......) Nomenclatura para genes e marcas genéticas 3 letras em itálico ou sublinhado indica locus genético auxotrófico (his ou his -1) Varias enzimas usa letras maiúsculas para indicar locus (hisA, hisB) O fenótipo é escrito em letra maiúscula His+ ou His
Escherichia coli -DH10B F- endA1 recA1 galE15 galK16 deoR nupG rpsL ΔlacX74 Φ80lacZΔM15 araD139 Δ(ara,leu)7697 mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) λ- - BL21 (AI) F– ompT gal dcm lon hsdSB(rB- mB-) λ(DE3 [lacI lacUV5-T7 gene 1 ind1 sam7 nin5]) http://openwetware.org/wiki/E._coli_genotypes#BL21.28AI.29
Mapa de marcas e genético 4.609.221 pares de base Conjugação e mutantes auxotroficos Sequenciamento
Plasmídeo DNA extra cromossomial São menores que o principal Alto replicativos tamanho de 1 a > 200 Kpb Determinam característica com resistência a antibióticos ou síntese de enzimas de restrição Deles derivam os vetores utilizados na biologia molecular Clonar fragmentos
Tipos de plasmídeos
Vetores de clonagem Plasmídeo - 0,1 a 10 Kb pBR322; pUC; pGEM; pBluescript; pET Insertos: genômico, transcrito reverso de mRNA (cDNA), subclonagem ou sintético
Vetores de clonagem Plasmídeo Características para uso: origem de replicação marcadores de seleção resistência a antibiótico (ampR, tetR, CamR, KanR, ) gene lacZ - amino terminal b-galactosidase (complementa) IPTG e X - Gal sítio múltiplo de clonagem (MCS) tamanho (quanto menor melhor!) Manipulação após purificacão larga escala “mini-prep” ou lise alcalina
Clonagem
pBR322 Plasmídeos naturais pBR322 = R1 + R6.5 + pMB1 1o plasmídeo -1977 Bolivar et al 1977 4363 pb Plasmídeos naturais pBR322 = R1 + R6.5 + pMB1
Seleção Transformação Placa Réplica
pUC8 1982 Vieira & Messing (pBR322 and M13mp8)
Plasmídeo pUC Mutanção no gene rop Sistema lacZ’ Adicionar ao meio Permite um maior numero de copias por celula Sistema lacZ’ Adicionar ao meio IPTG = isopropil thio galactose X-Gal = 5-bromo-4-cloro-3-indolil-b-d-galactopiranosídeo (branco/azul)
Bactérias para Transformação Células não apresentam fator de conjugação Não apresentam DNA plasmidial Precisam ser preparadas Tornar-se competentes Transformação Quimiotransformação Eletroporação F-
Prática Microbiológicas
Condições Estéril Ambiente de manipulação Regentes e meio de cultivo Vidraria Práticas devem manter o ambiente estéril Fluxo Laminar
Cultivo e conservação Meio cultivo Indefinido definido Consevação de microrganismos Meses – placa de petri a 4oC, tubo inclinado. 1ano – “stab” 4 ano – glicerol 15-20% a -70 oC DMSO entre 7-8% a -70 oC
Inoculação Inoculação Estoque ou de um cultivo
Isolamento Colônia isolada formada a partir de 1 UFC (unidade formadora de colônia) Estoque ou de um cultivo Certificar da pureza do isolado
Curva de Crescimento Trabalhar com DNA recombinante priorizar fase exponencial (107 UCF, 109 UCFdificulta aeração) Inoculo inicial, colônia isolada, pré-cultivo (109), diluir de 10 ou 100 vezes, avaliar curva de crescimento por algumas horas
Curva de Crescimento
Pratica Microbiológicas-Contagem Diluição Serial 1UCF entre 8-16hs forma uma colônia visível ao olho nu Absorbância 400-600 nm 0,7 limite
Transferência horizontal de DNA