Luis Gustavo Carvalho Pacheco IMUNIZAÇÃO ORAL CONTRA A ESQUISTOSSOMOSE COM Salmonella typhimurium ATENUADA CARREANDO PLASMÍDEOS (VACINAS DE DNA) PORTADORES DO GENE Sm14. Luis Gustavo Carvalho Pacheco Orientador: Prof. Dr. Vasco Azevedo Co-Orientador: Prof. Dr. Alan Lane de Melo

LABORATÓRIOS Genética Celular e Molecular (LGCM), Dep. de Biologia Geral. Taxonomia e Biologia de Invertebrados, Dep. de Parasitologia. Imunologia das Doenças Infecciosas, Dep. de Bioquímica e Imunologia.

RESULTADOS E DISCUSSÃO PLANO DE APRESENTAÇÃO INTRODUÇÃO OBJETIVOS MATERIAIS E MÉTODOS RESULTADOS E DISCUSSÃO CONCLUSÕES AGRADECIMENTOS

VACINA DE DNA Histórico e conceito Mecanismos de indução de resposta imunológica. Vias de administração.

BACTÉRIAS CARREADORAS Vantagens. Mecanismo de transferência de plasmídeos vacinais. Trabalhos com gene repórter. Outras doenças.

Ainda não há trabalhos na literatura relatando o uso de linhagens atenuadas de Salmonella como carreadoras de vacinas de DNA contra doenças parasitárias, incluindo esquistossomose.

Vermes do gênero Schistosoma ESQUISTOSSOMOSE Vermes do gênero Schistosoma Problema sócio-econômico e de saúde pública Pessoas em risco: quase 800 milhões Pessoas infectadas: cerca de 200 milhões No Brasil: ~6,4 milhões (NE e MG) Ciclo biológico (BERGQUIST et al., 2002; KATZ & PEIXOTO, 2000)

CICLO DE VIDA DE SCHISTOSOMA spp. www.dpd.cdc.gov/dpdx/HTML/ Frames/S-Z/Schistos...

ESTRATÉGIAS DE CONTROLE Saneamento básico Quimioterapia: oxamniquina e praziquantel Re-infecção em áreas endêmicas VACINA EFETIVA (proteção a longo prazo)

CONCEITO DE VACINA PROTETORA Diferente do normalmente associado com vacinas. Imunidade parcial: diminuição da carga parasitária. menos ovos acumulados = redução da reação granulomatosa. menos ovos liberados para o ambiente. (BERGQUIST et al., 2002)

CARACTERÍSTICAS IMUNOLÓGICAS Natureza provável da resposta imunológica: dicotômica: células Th1 e Th2 variação na produção de citocinas e imunoglobulinas pelo hospedeiro, de acordo com a fase de desenvolvimento do parasito. (AL-SHERBINY et al., 2003; HOFFMANN & WYNN, 2000)

CANDIDATOS VACINAIS 6 antígenos de Schistosoma escolhidos pela OMS como os mais promissores, utilizando proteína recombinante. Sh28GST em fase mais avançada de estudos: BILHVAX (proteína recombinante) diminuição de fecundidade fase II de testes clínicos

SM14 FABP (fatty acid-binding protein). Aquisição e utilização de ácidos graxos por diferentes organismos. Vacina bivalente anti-helmíntica. (TENDLER et al., 1996) Vacina de DNA com Sm14. (NASCIMENTO et al., 2002)

OBJETIVO GERAL Desenvolver e avaliar a eficácia de uma nova estratégia de imunização contra a esquistossomose experimental.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS Transformar a linhagem atenuada SL3261 de Salmonella typhimurium com o plasmídeo vacinal. Digestão e sequenciamento de pCI-Sm14. Ensaios de imunização oral de camundongos SWISS. Avaliar produção de anticorpos. Avaliar proteção conferida aos camundongos contra a esquistossomose experimental.

MATERIAIS E MÉTODOS Salmonella typhimurium SL3261 TRANSFORMAÇÃO pCMV pCI-neo Amp TRANSFORMAÇÃO pCMV pCI-Sm14 Amp CURVAS DE CRESCIMENTO SEQUENCIAMENTO RESTRIÇÃO ENZIMÁTICA ENSAIOS DE IMUNIZAÇÃO ORAL

ENSAIOS DE IMUNIZAÇÃO ORAL 7 doses de 109 u.f.c foram administradas, no intervalo de 30 dias. 10-1 10-2 10-7 Meio + Antib. + Bactéria O.N. Diluição1\50 Fase estacionária Fase exponencial 4:30 hs depois O.D. 0,8-0,9 ... (~10-8 a 10-9 UFC/ml) Imunização com 100 µl Meio da fase exponencial Concentração (5 X 109 UFC/ml)

MATERIAIS E MÉTODOS 3 ANÁLISES DE PROTEÇÃO 1 ANÁLISE DE RESPOSTA IMUNE HUMORAL 2 INFECÇÃO EXPERIMENTAL RECUPERAÇÃO DOS VERMES

DIGESTÃO E SEQUENCIAMENTO DE pCI-Sm14 Foi confirmada a integridade estrutural do plasmídeo vacinal. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 PM 5000pb 2000pb 1000pb 400pb CANALETAS 8 E 9: Nhe I + Not I

CURVAS DE CRESCIMENTO 2,36 x 109 4,75 x 105 5,54 x 108 1,6 x 105

Vermes recuperados (X ± ) ANÁLISES DE PROTEÇÃO Tratamento Nº Vermes recuperados (X ± ) % Proteção Valor p 1º Ensaio de Imunização PBS 6 16,5 ± 3,4 _ SL3261 14,3 ± 2,9 13,3 0,264 SL3261 (pCI-neo) 13,5 ± 2,7 18,2 0,122 SL3261 (pCI-Sm14) 5 12,2 ± 1,8 26,0 0,032* 2º Ensaio de Imunização 7 20,6 ± 8,3 22,3 ± 10 16,7 ± 7,8 18,9 0,388 8 21,5 ± 6,9

Número de fêmeas de S. mansoni recuperadas por camundongo experimental PBS SL3261 pCI-neo pCI-Sm14 PBS SL3261 pCI-neo pCI-Sm14 1º ENSAIO DE IMUNIZAÇÃO 2º ENSAIO DE IMUNIZAÇÃO

Contagens de ovos maduros e imaturos de S Contagens de ovos maduros e imaturos de S. mansoni/ grama de fragmento intestinal dos camundongos. Estágio dos ovos PBS SL3261 SL3261 (pCI-neo) SL3261 (pCI-Sm14) 1º Ensaio Ovos imaturos/nº de fêmeas recuperadas 751,45 ± 512,21 698,55 ± 566,76 630,75 ± 292,64 573,93 ± 448,13 Ovos maduros/nº de fêmeas recuperadas 201,90 ± 101,46 441,17 ± 497,26 239,20 ± 89,24 325,5 ± 139,01 2º Ensaio 611,83 ± 381,15 993,61 ± 811,77 969,43 ± 556,60 660,77 ± 235,98 200,64 ± 138,49 470,09 ± 571,76 398,71 ± 187,59 303,97 ± 191,21

Contagens totais de ovos de S Contagens totais de ovos de S. mansoni/ grama de fragmento intestinal dos camundongos 1º ENSAIO DE IMUNIZAÇÃO 2º ENSAIO DE IMUNIZAÇÃO

ANÁLISE DE RESPOSTA IMUNE HUMORAL PRODUÇÃO DE IgG anti-Sm14 15 30 45 60 75 90 1º ENSAIO DE IMUNIZAÇÃO * 15 30 45 60 75 90 2º ENSAIO DE IMUNIZAÇÃO

CONCLUSÕES Não é possível afirmar que a imunização oral com a linhagem vacinal confere proteção a camundongos SWISS, após a infecção experimental com cercárias de S. mansoni. A administração da linhagem de S. typhimurium carreadora de vacina de DNA induz produção de anticorpos IgG anti-Sm14 nos camundongos.

AGRADECIMENTOS Pai, mãe e irmãos. Amigos de BH (Pterodactilo’s Corporation); Amigos de Sete Lagoas; Carol. Professores Vasco Azevedo e Alan de Melo. Colegas do LGCM, do LTBI e do GIDE. Pessoal do LIDI e do Lab. Imunoparasitologia. Pessoal da Biologia e da Genética.

Candidatos vacinais contra a esquistossomose Antígeno Estágio expresso Propriedade particular Proteção conferida (%) Cam. Rato Outros (GST 28) Todos estágios Enzima 30-60 40-60 40 (primata) (Sm97) Esquistossômulo verme adulto Proteína muscular 30 (IrV-5) 50-70 95 25 (MAP-4) 30-40 Sm23 (MAP-3) Proteína integrada à membrana 40-50 Sm14 Esquistossômulo verme adulto Antígeno de membrana 65 90-100 (coelho)

VACINA DE DNA

VIAS DE ADMINISTRAÇÃO

MECANISMOS DE TRANSFERÊNCIA DE PLASMÍDEOS VACINAIS POR BACTÉRIAS CARREADORAS WEISS & CHAKRABORTY, 2001.

ALGUMAS VACINAS DE DNA CARREADAS POR SALMONELLA Linhagem Antígeno Doença Resposta imunológica S. typhimurium aro - Listeriolisina (Listeria monocytogenes) Infecção instestinal Humoral e celular Antígeno de superfície do vírus da hepatite B Hepatite B Glicoproteína D do vírus da herpes Herpes ESAT-6 (Mycobacterium tuberculosis) Tuberculose - Peptídeo NS3 do vírus da hepatite C Hepatite C Celular S. typhimurium aro - HIV-1 Env AIDS

1798 1981 1992 Varíola Hepatite B VACINAS DE 1ª GERAÇÃO 2ª GERAÇÃO VACINAS DE DNA