Técnicas Moleculares para detecção de patógenos ambientais Ecologia Microbiana Dra. Ana Paula Ramos

Objetivos da Aula: Informação genética Replicação do DNA e elementos envolvidos Técnicas moleculares mais usadas Isolamento de material genético Técnicas de amplificação de ácidos nucléicos PCR e variações, PCR em tempo real Técnicas de amplificação do sinal -Hibridizações Fase sólida Blothings (Southern, Northern, Dot Blot) Fase líquida Técnicas para análise de seqüências -RFLP -RAPD Aplicações das técnicas

Composição do DNA e do RNA DNA e RNA: estrutura, replicação e transcrição Ácidos Nucleicos são formados por “blocos de construção pareados”: purinas e pirimidinas (bases nitrogenadas) fosfato e açúcar Ligações químicas Composição do DNA e do RNA - DNA: carrega a informação genética - RNA: molécula intermediária entre a informação e a expressão gênica

DNA e RNA: estrutura, replicação e transcrição Replicação do DNA: várias enzimas DNA Polimerase SSB (Single Strand Binding Protein) Primase Helicases DNA ligase

DNA RNA DNA e RNA: estrutura, replicação e transcrição Adenina Guanina Citosina Timina Adenina Guanina Citosina Uracila Purinas Pirimidinas Açúcar Desoxirribose Ribose Fita dupla Fita simples

DNA e RNA: estrutura, replicação e transcrição Transcrição e Tradução (expressão gênica): dogma central É o processo pelo qual uma molécula de RNA é sintetizada a partir da informação contida na sequência de nucleotídeos de uma molécula de DNA de fita dupla

Por que métodos moleculares?? Metodologia clássica x Métodos moleculares Dificuldade em recuperar as células de um sistema Microrganismos pouco concentrados em amostras ambientais (água...) Alto número de microrganismos viáveis, mas não cultiváveis (91 a 99%)

Estratégias gerais para estudar seqüências específicas de DNA Amplificação específica Amplificação in vitro Detecção específica Hibridizações População a ser estudada Análise de seqüências RFLP, RAPD e sequenciamento

Isolamento e purificação do material genético Remover qualquer material ou componente celular que possa interferir nas técnicas moleculares Recuperação celular: por centrifugação Lise celular: detergentes Desproteinização: uso de enzimas Extração de ácidos nucléicos Purificação de ácidos nucléicos Métodos diferentes para amostras diferentes

PCR (Reação em Cadeia da Polimerase) Amplificação in vitro de ácidos nucléicos: aumento da possibilidade de visualizar estas moléculas DNA molde (alvo) Iniciadores Nucleotídeos (dNTP’s) Íons Magnésio (necessários para ativar a enzima) DNA polimerase Tampão (manutenção do pH ótimo) Desnaturação: 95°C Anelamento: 55°C Extensão: 72°C 25 a 40 ciclos

REAÇÃO EM CADEIA PELA POLIMERASE -PCR Seqüência alvo

Ciclo da PCR - etapa 1 DESNATURAÇÃO DO DNA Seqüência alvo

HIBRIDIZAÇÃO DOS INICIADORES NO DNA ALVO Ciclo da PCR - etapa 2 HIBRIDIZAÇÃO DOS INICIADORES NO DNA ALVO Seqüência alvo 3’ 5’ 5’ 3’ Iniciador 1 Iniciador 2 3’ 5’ 5’ 3’ Seqüência alvo

SÍNTESE DA CADEIA COMPLEMENTAR PELA TAQ DNA POLIMERASE Ciclo da PCR - etapa 3 SÍNTESE DA CADEIA COMPLEMENTAR PELA TAQ DNA POLIMERASE Seqüência alvo 3’ 5’ 5’ 3’ Iniciador 1 Taq DNA Polimerase Iniciador 2 3’ 5’ 5’ 3’ Seqüência alvo

Final do primeiro ciclo da PCR DUAS CÓPIAS DA SEQÜÊNCIA ALVO Seqüência alvo Seqüência alvo

Ciclos da PCR Desnaturação Hibridação Final do ciclo Extensão

Produtos de PCR 7 ciclos = 128 Amplicons 1 ciclo = 2 Amplicons 2 ciclos = 4 Amplicons 3 ciclos = 8 Amplicons 4 ciclos = 16 Amplicons 5 ciclos = 32 Amplicons 6 ciclos = 64 Amplicons 7 ciclos = 128 Amplicons No. No. Amplicons Ciclos Copias do DNA alvo 1 2 2 4 3 8 4 16 5 32 6 64 20 1.048.576 30 1.073.741.824

Visualização dos produtos de PCR por Eletroforese Separação de moléculas por peso molecular: ácidos nucléicos ou proteínas Diferença de potencial entre dois eletrodos (+ e -) Matriz polimerizada : agarose e poliacrilamida

Variações da PCR RT-PCR – Transcrição reversa Nested-PCR – Iniciadores internos, dois “rounds” de amplificação PCR Multiplex – Vários iniciadores ICC/PCR – PCR associada à cultura celular

Não segue o dogma central da biologia molecular RT- PCR Não segue o dogma central da biologia molecular cDNA Transcrição Reversa RNA Trabalhar com DNA é mais estável ! Utilizado em estudos de expressão gênica Utilizado para detecção viral (vírus de RNA)

Nested PCR

Multiplex PCR

ICC-PCR (Integrated Cell Culture - PCR) Para os casos nos quais há necessidade de aumentar a concentração microbiana e há muitos inibidores: amostras ambientais Amostra processada  Cultura Crescimento / efeito citopático Lise celular e extração dos ác. nucléicos do lisado RT-PCR / PCR Eletroforese: produto específico Deixa-se um tempo padronizado onde não é necessário observar crescimento / ECP, mas já é possível a detecção por PCR Ajuda na remoção de inibidores o que aumenta a sensibilidade da PCR Volume de análise muito maior

PCR em tempo real - quantitativo

Diagrama de um “sinalizador” molecular Diagrama de um “sinalizador” molecular. Este sinalizador tem 33 nucleotídeos com um corante fluorescente (R) ligado ao terminal 5´ e um bloqueador de sinais (Q) no terminal 3´. As 9 bases do terminal 5´pareiam com as 9 bases do terminal 3´ e faz com que o sinal fluorescente fique muito próximo ao bloqueador. Quando o fluorescente é excitado ele é bloqueado pelo bloqueador e nenhuma fluorescência é detectada. As bases em rosa representam sequências que pareiam especificamente com o produto de PCR.

Detecção do produto do PCR pelo “sinalizador molecular” Detecção do produto do PCR pelo “sinalizador molecular”. Quando o sinalizador liga-se ao produto de PCR (T°C de 5 a 10°C mais elevada que a T°C de anelamento dos primers), ele vai fluorescer quando excitado no comprimento de onda adequado. A quantidade de fluorescência é diretamente proporcional à quantidade de produto de PCR amplificada.

MÉTODO TAQMAN Sonda TaqMan® complementar a uma região interna do produto de PCR e ligada a um composto fluorescente. Quando a amplificação começa, a DNA polimerase corta a sonda, e a fluorescência é liberada. A fluorescência é liberada a cada ciclo, gerando um sinal fluorescente específico da seqüência.

Hibridização Moléculas individuais de ácidos nucléicos (fita simples) apresentam a capacidade de formar moléculas de fita dupla (hibridização) necessidade de alta complementaridade entre as bases para que isso aconteça; Sensibilidade menor que os métodos de amplificação gênica Utilizada para confirmação

Hibridização

Hibridização Sondas são marcadas direta ou indiretamente com enzimas, radioisótopos ou substratos quimioluminescentes / antigênicos, possibilitando a hibridização e detecção Fase líquida: captura híbrida Fase sólida: Southern e Northern blot, Dot Blot e Colony Blot

Fase Líquida: captura híbrida

Fase sólida: Ácidos nucléicos digeridos com enzimas de restrição e imobilizados em um suporte sólido Enzimas de Restrição: enzimas isoladas de procariotos que reconhecem seqüências específicas no DNA dupla fita.

Fase sólida: Ácidos nucléicos imobilizados em um suporte sólido Southern e Northern Blot

Dot Blot : ácido nucléico diretamente imobilizado em membranas, vácuo

Análise de seqüências RFLP (Restriction Fragment Lenght Polymorphism – Polimorfismo do tamanho dos fragmentos de restrição) – Tipagem exemplo: variações dentro do gene rRNA, que é conservado Comparação entre o número e o tamanho dos fragmentos; Variações no tamanho dos fragmentos gerados por distintas amostras de DNA após clivagem enzimas de restrição; Padrões de bandas diferenciados indicam organismos distintos geneticamente (mesma espécie ou não);

Análise de seqüências RAPD (Randomly Amplified Polymorphic DNA – DNA polimórfico randomicamente amplificado)- DNA fingerprinting PCR utilizando-se iniciadores aleatórios em baixa estringência (especificidade no produto de DNA a ser amplificado) Não é necessário um conhecimento prévio do genoma Uniformidade no padrão de bandas para espécies relacionadas

DNA Desnaturação a 95oC DNA

Extensão a 72ºC

Fragmentos de RAPD 400bp 310bp 260bp 75bp

Visualização de Fragmentos de RAPD

Utilização de técnicas moleculares na avaliação e detecção da diversidade microbiana Diferentes técnicas : quando se conhece ou não o genoma do organismo estudado Processamento das amostras é de extrema importância ácidos nucléicos de boa qualidade, pureza e, principalmente, com mínimo de inibidores

Análise de contaminação bacteriana e viral em moluscos

Análise de contaminação bacteriana e viral em moluscos: O LVA vem trabalhando na avaliação da contaminação em moluscos desde aproximadamente 10 anos; Importância devido o grande destaque de Florianópolis e região na Maricultura Moluscos: animais filtradores concentram patógenos Salmonella spp. Vírus: RNA Hepatite A, Rotavírus, Norovírus, Poliovirus DNA Adenovírus, Poliomavírus,

Necessidade de diminuição de inibidores presentes na carne de ostras e enriquecimento da amostra em meio de cultivo (viabilidade e aumento do número de células)

Análise de contaminação viral em amostras de águas:

Método de filtração e concentração (Katayama et al., 2002) Centriprep - Millipore

Problemas... Alto custo da infra-estrutura do laboratório e reagentes; Diferenciação entre células viáveis e não viáveis; depende da técnica e do organismo a ser estudado Dificuldade em pesquisar quando o genoma do microrganismo não é conhecido.

PROJETOS EM ANDAMENTO 2008-2011: MAPA L-2/CNPq: IMPLEMENTAÇÃO DE TÉCNICAS DE DEPURAÇÃO DE OSTRAS DE CULTIVO QUE VISEM GARANTIR A QUALIDADE E INOCUIDADE DO PRODUTO. 2007-2009: Ed. Universal/CNPq 2007 : VALIDAÇÃO E APLICAÇÃO DE MÉTODOS MOLECULARES PARA QUANTIFICAÇÃO DE VÍRUS HUMANOS DE INTERESSE EM SAÚDE PÚBLICA E MEIO AMBIENTE: Rotavírus, adenovírus e vírus da hepatite A como modelos de contaminação de águas ambientais 2007-2009: Ed. FINEP/SEBRAE: Produção de ostras triplóides da espécie Crassostrea gigas.. 30/11/2008 a 30/10/2009 FAPESC: Produção de sementes de ostras triplóides (3n) para a maricultura catarinense. 2009-2010: AECID: “Agencia Espanola de Cooperación Internacional para el Desarollo” (INTERNATIONAL COLABORATION BETWEEN UFSC AND BARCELONA UNIVERSITY FOR HUMAN EXCHANGE) : Desenvolvimento de métodos para a detecção e quantificação de vírus em moluscos. 49