Diversidade microbiana (Independentes de cultivo e moleculares) Técnicas modernas Expressões da diversidade

Avaliação da diversidade microbiana ( métodos independentes de cultivo) Heterogeneidade (Evenness) abundância relativa de cada grupo Riqueza número de grupos presentes Técnicas que envolvem ácidos nucleicos (RNA ou DNA). Essas técnicas apenas permitem avaliar diversidade (quem está ali?) e não o potencial metabólico ou atividade, a menos que genes metabólicos ou seus transcritos sejam usados nas sondas. Métodos mais diretos e analíticos (como FAME) podem também permitir a avaliação da diversidade.

Dogma Central da Biologia Sequências rRNA são extremamente importantes em estudos filogenéticos porque são conservadas (evoluiram lentamente) participando na síntese da estrutura dos ribossomas e de proteínas. rDNA indica os genes que codificam para o RNA ribossômico. Maioria dos genes metabólicos são regulados ao nível da transcrição e podem não ser expressos. Portanto os genes metabólicos podem estar presentes mas não ser expressos - potencial metabólico. Se o transcrito do gene é expresso então ele será expresso e seu produto será sintetizado (atividade metabólica).

Características dos ácidos nucleicos Dois tipos de ácidos: RNA e DNA DNA é codificado por 4 blocos intercambiáveis denominados bases, Adenina, Timina, Citosina e Guanina, com Uracila raramente substituindo a Timina RNA tem 5 bases diferentes: Adenine, Guanine, Citosina e Uracila, e mais raramente a Timina.

Deoxyribonucleic Acid Ácido desoxiribonucleico DNA

Gene16S rDNA) Porque os estudos de diversidade usam o rDNA? Cerca de 1500 pb codificam para a subunidade 16S da molécula de RNA. Parte destas sequências são conservadas para a maioria dos seres vivos. Herança metabólica do último ancestral comum. Blocos conservados podem ser explorados para amplificação dos genes in vitro. Regiões variáveis são usadas na taxonomia - filogenética

rDNA Mapa de variabilidade de SSU rDNA bacteriano Estrutura 1ª (sequências), 2ª (dobraduras) e 3ª ( 3 dimensões) Mapa de variabilidade de SSU rDNA bacteriano Vermelho = genes altamente conservados SSU (small subunit) 16S

Como se replica o DNA? (Complementaridade das bases) Abertura da dupla fita até cerca da metade, via reações químicas simples e reconstituição da outra metade de cada fita por imersão em uma mistura composta pelas quatro bases. Cada base pode se combinar apenas com uma base única complementar. Portanto, uma base na “fita antiga” (+) define qual base pode ocorrer na “fita nova” (-) Dessa forma, após cada abertura da fita, são coletadas do substrato réplicas completas da fita original, exceto quando ocorrer uma mutação.

Replicação do DNA

Sondas de ácidos nucleicos Sondas de ácidos nucleicos Sondas são pequenas porções de DNA (ou RNA) de sequência conhecida usadas para identificar a presença de DNA complementar na amostra. Ocorre pareamento espontâneo resultante da complementaridade das bases é o princípio das técnicas usadas para detectar e caracterizar genes. Tecnologia das sondas gênicas é usada para identificar genes individuais ou sequencias de DNA. A ligação das 2 fitas (sondas + amostra ) se denomina IBRIDIZAÇÃO. Duas fitas devem ter pelo menos 16-20 bases complementares consecutivas para formar uma fita estável e complementar. 1. Sondas podem ser marcadas com: radioisotopos,enzimas, fluorocromo, substratos quimioluminescentes. 2. Hibridização pode ocorrer em suportes sólidos ou líquidos

Tipos de sondas gênicas Sonda é uma “assinatura das seqüências genéticas de um organismo ou um gene” Sonda funcional - baseada nos genes de uma função específica. Sonda filogenética - baseada nas seqüências das subunidades rRNA. Sonda de oligonucleotídio - pequena sequência, de 20 a 70 nucleotídios.

Dot-Blot Amostra (mistura que contém a molécula alvo) é aplicada em uma membrana, depois aquecida para desnaturar o DNA; Sondas marcadas são adicionadas; A amostra é lavada para remoção da sonda não hibridizada e avaliar os reagentes. Método qualitativo, Por vezes difícil de interpretar.

Hibridização dot-blot Detectar a presença ou ausência de biomoléculas Não informa sobre os tamanhos 100 % transgênico Figure 1 DNA–DNA hibridização dot-blot entre o genoma de milho e um sonda CaMV p-35S (vírus do mosaico da couve-flor). Top row: 1, 100% transgenic; 2, 10% transgenic; 3, 5% transgenic; 4, 1% transgenic, 5, 0.5% transgenic; 6, historical maize negative control; 7, water negative control; 8, Diconsa sample K1. Bottom row: 1, criollo sample B1; 2, criollo sample B2; 3, criollo sample B3; 4, criollo sample A1; 5, criollo sample A2; 6, criollo sample A3; 7, Peru maize negative control P1; 8, water negative control.

Southern Blot Fragmentos de DNA separados por eletroforese. Porções DNA desnaturados são transferidos para uma membrana para realização da reação de hibridização. Colocar membrana no topo de um gel e permitir que tampão + DNA se transfira para a membrana. Uma vez na membrana aquecer ou usar UV para as fitas se ligarem as membranas para imobilização. Adicionar sondas para hibridização ocorrer. Sondas adicionadas em excesso de forma que moléculas-alvo se re-arranjem e se liguem na sonda.

Southern Blot membrana SB se baseia no fato que fragmentos de DNA aderem a membranas de celulose ou nylon. A membrana é colocada acima de um gel de agarose e abaixo de um material absorvente (papel, esponja). Com o tempo fragmentos de DNA se transferem do gel para a membrana por capilaridade. Após a transferência dos fragmentos a membrana é lavada, e os fragmentos expostos a UV ou calor para fixação. A membrana torna-se uma imagem do DNA presente na agarose.

Técnica do Southern Blot

Endonucleases (ou enzimas) de restrição “tesouras moleculares” São proteínas que reconhecem sítios específicos das sequências de nucleotídeos e clivam ambas as fitas de DNA. Descoberta na década de 70 como um mecanismo de defesa de bactérias contra bacteriófagos, hoje é uma ferramenta da biologia molecular para fabricação de novas moléculas.

Southern Blot - teste de paternidade Mãe (azul) Pai (amarelo) Seus 4 filhos : D1 (filha biológica), D2 (enteada, filha da mãe e ex-marido, (vermelho), S1 (filho biológico), and S2 (filho adotivo,não relacionado biologicamente com pais).

Northern Blot (Utiliza RNA em vez de DNA, propiciando estudos de expressão gênica) Permite a investigação do peso molecular de um mRNA e avaliar quantidades relativas de mRNA em diferentes amostras. RNA (RNA total ou apenas mRNA) é separado por eletroforese. O RNA é transferido para membrana especial (nitrocelulose). A amostra é incubada com uma sonda de DNA fita única. A sonda hibridizará caso ocorra complementaridade formando uma molécula dupla fita (molécula RNA-DNA). A sonda é marcada com radioatividade ou enzima (fosfatase alcalina ou peroxidase). A localização da sonda é revelada por incubação com uma substância que ligada a enzima converte-se produto colorido ou que exposta a raios X pode ser revelada.

Northern Blot

Hibridização em solução Ambos ácido nucleico-alvo e sonda interagem livremente na solução. Neste caso maior sensibilidade do que em suporte sólido Requer menos amostra Sonda deve ser fita unica e não deve formar dupla hélice (self-annealing). Adaptável a automação particularmente quando se usam marcadores quimioluminiscentes. Rápido resultado, em poucas horas.

Hibridização em solução

Biochips (Análise do perfil de expressão de comunidades) Microarranjos de DNA “DNA microarrays” Coleção de porções de DNA aderidas a suportes sólidos (vidro, plástico ou silicone) formando um conjunto que visa monitorar a expressão de múltiplos genes.

Biochips: microarranjos de DNA Um chip de DNA é um biosensor que analisa informações genéticas de humanos e bactérias. Utiliza a complementaridade das 4 bases (Adenina, Timina, Guanina e Citosina) no qual A emparelha com T e G emparelha com C através de ligações de H. Uma solução com as sequências de DNA contendo genes conhecidos (SONDA de DNA) é colocada no suporte em micrositios (alguns μ de diâmetro) e arranjados em filas. Genes extraídos de amostras e amplificados são colocados no chip de DNA, possibilitando que caracteristicas como a presença de genes mutantes ou genes especificos sejam detectados. Importante para amostras ambientais, diagnóstico de doenças (câncer).

Como um biochip é produzido? Usa DNA, RNA ou oligonucleotídeos. Também podem ser de proteínas e de anticorpos. Permite a realização de milhares de reações biológicas de uma só vez.

Etapa 1: produção de sondas. Usando técnicas convencionais, como PCR e síntese bioquímica, fitas de DNA específicas são obtidas e purificadas. Variedade ampla de sondas são comercializadas.

Etapa 2: manufatura do biochip com sonda integrada Empresas usam robótica e nano-manufactura para colocar no vidro ou plástico os receptáculos das sondas de DNA.

Empresas usam uma variedade de processos (eletroforese até ligação usando robótica) para aderir o material genético ao substrato. Condições de assepsia total (salas esterilizadas) para impedir contaminações nesta etapa.

DNA Chip

Hibridização in situ Alvo: ácido nucleico em células intactas. Fornece informação sobre a presença de DNA específico e sua distribuição ou localização em tecidos ou superfícies. Sondas devem ser suficiente pequenas para atingir o DNA. Podem usar marcadores radioativos ou fluorescentes. Requer experiência para interpretação.

Hibridização in situ com fluorescência (FISH) Apresentação da aluna Catarina Figueiredo (MS em Biotecnologia)

Fluorescent In Situ Hybridization - FISH Bactérias do grupo alvo aparecem em vermelho. Restantes bactérias aparecem em azul (cores artificiais)

FISH: Bactérias incubadas em tetrazolium e coloridas com DAPI Azul: corante DAPI Vermelho: Grânulos internos indicando bactérias ativas em processo respiratório. DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) é um corante fluorescente que se liga fortemente com o DNA.

Reação de amplificação do DNA – PCR (amplificação gênica) O objetivo é fazer um número elevado de cópias de um gene ou de uma sequência. Células são separadas e lisadas DNA dupla fita é separado em fita única. Iniciadores (primers) são adicionados (pequenos fragmentos de DNA, 2-30 nucleotídios) Primers são segmentos complementares aqueles que fazem flanco a sequencia alvo Apenas os segmentos DNA alvo entre os primers serão replicados Cada ciclo térmico de PCR consiste de 3 etapas: Desnaturazção do DNA alvo (separação das fitas) 94 °C Anelamento por abaixamento da temperatura 55 °C Extensão ou síntese quando primers iniciam a síntese de DNA usando uma DNA polimearse. 72 °C Cada ciclo resulta no dobro das sequencias alvo (dura cerca de 60-90 segundos), e geralmente se usam 30 ciclos.

Taq polimerase É uma enzima termoestável isolada de uma bactéria Thermus aquaticus, que habita em regiões hidrotermais e geysers. "Taq polimerase" é uma abreviatura de Thermus Aquaticus Polimerase. É geralmente usada no PCR porque é razoavelmente barata e pode suportar as condições da técnica (temperatura de desnaturação).

PCR

PCR

O que fazer com PCR? Amplificar genes 16S rDNA diretamente de amostras ambientais. Usar primers específicos de certos grupos: detecção específica Detectar genes funcionais quando sua sequência é conhecida.

Métodos moleculares Sondas gênicas Hibridização Biochips PCR Marcadores genéticos

Perspectivas - O futuro? Técnicas dependentes de cultivo são essenciais apesar de lentas e trabalhosas. Como torná-las mais rápidas? Processador automático Amostras ambientais Diversidade microbiana, atividade, potencial metabólico,... Aumentar automação Usar tecnologia de microarranjos Uso da robótica

Expressões da diversidade Medidas objetivas simples Riqueza de espécies Fornecem informações sobre a variabilidade. Ex: Índice de Margalef D = (n-1)/ln N É uma medida utilizada em ecologia para estimar a diversidade de uma comunidade com base na distribuição numérica dos indivíduos das diferentes espécies em função do número total de indivíduos existentes na amostra analisada. 2 = baixa diversidade > 5 = alta diversidade

Modelos de distribuição de abundância Modelos estatísticos que permitem observar variabilidade (número de espécies) e a equitatividade (distribuição da abundância relativa, heterogeneidade). Distribuição Log-Normal Série geométrica Brocken stick Série logarítmica

Modelos de abundância Abundância Sequência das espécies Log normal Brocken stick Abundância Série log Série geométrica Sequência das espécies

Índices de heterogeneidade Índices complexos de calcular porém fornecem importantes informações complementando com outras informações Shannon e Simpson avaliam dominância e equitatividade

Sumário Diversidade tem dois componentes: - Variabilidade e heterogeneidade Etapas no cálculo 1. Identificar o número de tipos 2. Avaliar o número ou biomassa dentro de cada tipo 3. Usar estes valores nas expressões Pode-se calcular em diferentes níveis: - desde indivíduo até genético As técnicas tem sensibilidades diferentes e incluem: - técnicas dependentes de cultivo - técnicas independentes de cultivo

Próxima aula: Fatores determinantes ambientais FIM Próxima aula: Fatores determinantes ambientais

Glossário molecular cDNA Fazer copia do mRNA na forma de DNA Enzimas de restrição Cortar o DNA em pontos específicos, fragmentando-o DNA ligase Ligar fragmentos de DNA Vetores Transportadores de DNA para as células de forma a assegurar sua replicação Plamídios Tipo de vetor Transferência gênica Colocar um gene em uma célula Marcadores genéticos Para identificar células que foram transformadas Placas replica Fazer cópias exatas de colônias bacterianas em placas 9 PCR Técnica de amplificação de DNA 10 Sondas de DNA Identificar e marcar um pequena porção de DNA que contenha um seqüência especifica. 11 Shotgun Pesquisar um gene particular no genoma total 12 Genes antisense Parar a expressão de um gene na célula 13 Eletroforese Reparar fragmentos de DNA