Injetar e deixar 20 horas Células injetadas e reveladas para ativação de lacZ 20 horas depois da injeção Todavia, a idade da célula no momento da injeção era calculada sabendo a posição dela na placa (grid) e acompanhando o ciclo de divisão

Outros promotores, tecido- específicos, tb funcionam mais se injetados no início da fase S

Mas elas passam por +1 ciclo nessas 20 horas! O fato sugere que a competência foi adquirida logo na hora da injeção e não foi recuperada pelo ciclo Vamos esperar só 3 horas? –Injetar depois da div. –Tem que usar PCR –Deu igual! controle

Duas injetadas na mesma célula O repórter pode ser LacZ ou EGFP Células injetadas, espera-se algumas horas de acordo com protocolo Early S sempre mais ativa (na mesma célula)

Preparar nucleossomo e fazer PCR A detecção de lacZ (injetado) ou de actina (celular) foi igual, logo o DNA injetado virou nucleossomal!

Injeção de dois plasmídios com genes de tamanho diferente Um injetado no início e outro no final da fase S Preparação nucleossomal Precipitação de cromatina com anti - H4 acetilada PCR quantitativo do precipitado: early tem mais acetilação InputBound l

Controles Gene ativo: actina Gene Inativo: Ig-kappa earlylate l

TSA inibe desacetilase Early: não adianta inibir desacetilase Late: –Tratamento simultâneo reverte –Tratamento tardio não –Já empacotou! Estável! RT-PCR

Plasmídio que replica (origem BPV, célula com E1/E2) Qdo replica, plasmídio perde padrão de metilação bacteriana e fica resistente a Dpn I Em 3 horas eles replicam (30-40%) Imunoprecipitação do plasmídio com anti – H4 acetilada Elimina-se quem não replica com Dpn I

H4 desacetilada é comum no X tardio e bandas G Inseriram pUC por transfecção (ops, esse DNA agora é cromossômico) –Deve ter inserido em diferentes tipos de bandas Marcaram Early e Late replication com Budr Precipitaram com anti – H4 acetilada O ppt era enriquecido de cópias de pUC marcadas com BUdr early (mas não com BUdr late) – early = desacetilado

Onde fica a HDAC2? Em bandas G, de replicação tardia Competência transcricional é dependente da fase S Replicação precoce é montada em estrutura de cromatina mais acessível Replicação tardia em regiões inativas Eixo ao longo do tempo do ciclo celular que permite a manutenção de efeitos epigenéticos