Tópicos em bioquímica: DNA E CROMOSSOMOS CROMOSSOMOS E SUBDOMÍNIOS CROMOSSOMICOS CONSTITUEM UNIDADES DISTINTAS NO NÚCLEO INTERFÁSICO

INTRODUÇÃO Os cromossomos formam territórios distintos no núcleo interfásico, delimitando domínios formados pelos seus braços Recentemente, relações espaciais e funcionais tem sido descritas entre domínios e territórios cromossômicos (fábricas de DNA e RNA, fatores de splicing, etc)

Territórios cromossômicos e seus domínios: Domínios cromossômicos

Antes de fazer inferências entre estrutura e função da cromatina, deve-se então compreender como é a organização espacial da cromatina. A QUESTÃO ENTÃO É: OS CROMOSSOMOS NO NÚCLEO INTERFÁSICO ESTÃO SOBREPOSTOS OU FORMAM TERRITÓRIOS MUTUAMENTE EXCLUSIVOS?

MATERIAL E MÉTODOS: Cultura das células: Marcação das células: As células das linhagens HA-1 e V79 foram incubadas em MEM com Sais de Hanks contendo FCS, glutamina, penicilina, streptomicina a 37 °C e 2% CO2. Marcação das células: A replicação foi marcada com IdUrd (iodo-desoxi-uridina) e com CldUrd (cloro-desoxi-uridina) por meio de dois métodos: FUSÃO DE NÚLCEOS MARCAÇÃO SEQUENCIAL

Timidinas Análogas: substituição Br I Cl

Plaqueamento das células Núcleo das células fundidas MÉTODO DE MARCAÇÃO I: FUSÃO DAS CÉLULAS Consistiu em obter núcleos com diferentes cromossomos marcados a partir da fusão de núcleos de duas populações de células marcadas diferentemente Plaqueamento das células IdUrd Shake-off +fusão (das mitóticas) CldUrd Núcleo das células fundidas

MÉTODO DE MARCAÇÃO II: MARCAÇÃO SEQUENCIAL Na 1ª fase S, IdUrd foi incorporado As células foram lavadas e cultivadas durante uma 2ª fase S em meio contendo CldUrd. As células passaram por uma 3ª fase S sem marcação

Esquema da marcação seqüencial:

VERIFICAÇÃO DA REPLICAÇÃO MARCADA: Os marcadores foram detectados por anticorpos específicos (originalmente para BrdUrd) e um anticorpo derivado de rato Coloração não-específica foi bloqueada CONTROLE: As células foram comparadas com células não marcadas e coradas com o marcador de DNA TROPO-3

Detecção da marcação por imunofluorescencia: Reconhecem os anticorpos Reconhecem os marcadores

VISUALIZAÇÃO E ANÁLISE: Utilizou-se um microscópio de fluorescência e o registro foi feito com uma câmera CCD Foram feitas imagens das fusões e marcações seqüenciais utilizando o CLSM Para determinar se havia sobreposições espaciais realizou-se a marcação com FICT e Texas Red e registrou-se e analisou-se as elevações cromáticas

RESULTADOS O experimento controle mostrou que a morfologia nuclear e a estrutura da cromatina não foi alterada. Todos os cromossomos foram uniformemente marcados

As bordas entre os cromossomos estavam bem definidas CldUrd (em verde) Os núcleos fundidos apresentaram um mosaico de domínios com ou outro marcador, com pouca sobreposição. As bordas entre os cromossomos estavam bem definidas Confirmando assim a discrição dos territórios e domínios IdUrd (em vermelho)

Revelou também subdomínios formados por (SCEs) formando um arlequim + IdUrd 1ª fase S A marcação seqüencial revelou um mosaico de domínios distintos contendo exclusivamente IdUrd, CldUrd ou nenhuma marcação. Indicando também a idéia de unidades discretas Revelou também subdomínios formados por (SCEs) formando um arlequim + CldUrd 2ª fase S 3ª fase S

Os sinais utilizados para verificar o cruzamento da área de borda, mostrou que havia limitada sobreposição Para verificar se ocorria um erro na técnica de visualização foi feito um experimento controle e visualização com linescan

Comparações com linescan: Experimento: Controle:

Admitiu-se que houve uma pequena sobreposição

A Cromatina apresentou regiões semelhantes a fibras que admitiam disposições irregulares e nunca contendo ambas as marcações.

DISCUSSÃO Baseando-se nas duas abordagens amostradas, os territórios cromossômicos são estruturas distintas e contém subdomínios discretos Os cromossomos podem penetrar em regiões de outros, mas sem se misturar, tomando formas irregulares Não se pode, porem excluir a possibilidade alguma sobreposição, com pequena quantidade de DNA envolvida

Esta parece ser uma característica comum a todos os eucariotos Nos locais onde ocorreu as SCEs ocorreu súbita mudança de marcação indicando que há um alto grau de compartimentalização nos territórios Estruturas similares às fibras observadas foram relatadas em estudos in vivo. Onde especula-se que elas possam corresponder a um alto grau de dobramento da cromatina

União de domínios (raro) Não se pode, porem excluir a possibilidade alguma sobreposição, com pequena quantidade de DNA envolvida Processos raros de mistura pode ocorrer em regiões de SCEs ou união de dois domínios (ex: duas fábricas de cromossomos diferentes se unirem). União de domínios (raro)

Experimentos com vimentina corroboram com a idéia de territórios Experimentos com FISH não são tão eficientes pois marcam apenas alguns cromossomos No leptóteno da espermatogênese poderia ocorrer mistura dos domínios

Por fim: Uma questão sobre este tema ainda permanece: Como as fibras estão organizadas dentro de um território? Cromatina dobrada e altamente misturada Subdomínios não se sobrepõem Teorias de organização funcional (não espacial) Os resultados do trabalho sugerem que há uma organização estrita da cromatina em unidades discretas, promovendo uma base para elucidar estudos de relações entre estrutura e função.

MORAL DA HISTÓRIA: Sua visão de cromatina depois da aula: Sua visão de cromatina antes da aula: