Tecnologia do DNA recombinante
A deficiência de hormônio do crescimento faz com que a pessoa fique com uma estatura baixa. Nesses casos, é necessário o uso hormônio do crescimento para que o crescimento dessas crianças melhore. O hormônio do crescimento foi um dos primeiros produtos da engenharia genética. Ele foi produzido em E. coli a partir de um gene humano fusionado com elementos reguladores bacterianos. Esse foi o segundo produto farmacêutico aprovado pelo FDA, em 1985. O primeiro foi a insulina humana, em 1982.
Como amplificar um gene de interesse
Tipo de DNA doador DNA genômico cDNA – DNA complementar
cDNA – contém apenas os éxons
DNA de interesse Formação de uma molécula de DNA recombinante vetor
Enzimas de Restrição
Como funciona a amplificação
VETORES Plasmídeos: são moléculas de DNA circulares, extracromossômicas, presentes em microrganismos, sendo que muitos se replicam autonomamente.
Estrutura de dois plasmídeos
Vetores de bacteriófagos A maioria fago labda Genoma do fago: 48.502pb 15kb são necessários para a lisogenia e podem ser removidos.
Clonagem usando o fago como vetor
Vetores cosmidiais É um híbrido entre plasmídeos e o fago labda Vantagens: capacidade do plasmídeo de replicação autônoma Capacidade do fago de embalagem do cromossomo Capacidade de 35 a 45kb
Estrutura de um cromossomo artificial bacteriano (BAC) usado para clonar grandes fragmentos de DNA (150 a 300kb)
Construção de bibliotecas de DNA Conjunto de clones de DNA, contendo coletivamente todo o genoma. DNA total digestão com enzimas de restrição inserção em vetores
Uma boa biblioteca tem todas as sequencias de DNA do genoma. Para genomas grandes são necessários milhares de clones O número de clones pode ser calculado: N=(ln(1-P)/(ln(1-f) P: probabilidade, f: fração do genoma em um clone de tamanho médio
Exemplo Drosophila genoma 100.000kb Inserto 40kb Probabilidade de 99% de certeza de uma seqüência estar na biblioteca: N=(ln(1-0,99)/(ln(1-(40/100000) N=11.513 clones
Exercício O genoma humano tem 3 bilhões de nucletídeos Utilizando BACs: insertos de 200kb Quantos clones são necessários para ter uma certeza de 95% de ter uma seqüência específica na biblioteca? N=44.979
Microsatélites
Teste de paternidade