Detecção por imunocitoquímica de VEGF no pénis do rato Cristina Resende Diana Cruz T6

Objectivo Mapear a localização preferencial do VEGF (vascular endothelial growth factor) no pénis do rato Insere-se num projecto de investigação do que tem como objectivo mapear e comparar a localização do factor de crescimento no pénis em diversos grupos de risco.

Histologia do pénis Componentes principais: Uretra 3 corpos cilíndricos de tecido eréctil 2 Corpos cavernosos - na parte dorsal Corpo esponjoso – anteriormente; a revestir a uretra Fig. 1: Corte transversal de pénis humano

Os corpos cavernosos são envolvidos por uma camada resistente de tecido conjuntivo denso - a túnica albugínea. O tecido eréctil que compõe os corpos cavernosos e o corpo esponjoso tem uma grande quantidade de espaços cavernosos separados por trabéculas de fibras de tecido conjuntivo e células musculares lisas. Fig. 2: Corte transversal de pénis humano (maior ampliação)

Fisiologia da erecção (I) Óxido nítrico – Essencial ao fenómeno de erecção Molécula sinalizadora parácrina Sintetizado a partir do aminoácido arginina Difunde-se directamente através da membrana plasmática das células alvo Molécula extremamente instável, com um tempo de semi-vida curto (alguns segundos)

Fisiologia da erecção (II) Fig. 3 Papel do óxido nítrico no relaxamento do músculo liso

Epidemiologia da disfunção eréctil estudos epidemiológicos demonstram uma associação entre o envelhecimento e a disfunção eréctil declínio da actividade sexual e da função eréctil com o envelhecimento Estima-se que a percentagem de homens sem disfunção eréctil diminui de 60 para 33% entre os 40 e 70 anos de idade.

associada a patologias concomitantes doença aterosclerótica das artérias penianas principal causa da disfunção eréctil relacionada com a idade Disfunção eréctil não é necessariamente uma consequência inevitável da idade associada a patologias concomitantes Factores de risco vascular como hipertensão, hipercolesterolemia, tabaco e diabetes  associados a maior probabilidade de disfunção eréctil

Outros factores de risco: declínio da produção hormonal, nomeadamente de androgénios Factores psicológicos Efeitos laterais de fármacos utilizados na terapêutica de patologias concomitantes

Importância do estudo Crescimento populacional Última década  grande preocupação nesta área Crescimento populacional Aumento da esperança média de vida Acréscimo importante na prevalência de diversas patologias, incluindo a disfunção eréctil Compreensão mais aprofundada dos mecanismos fisiopatológicos da disfunção eréctil com vista à orientação de novas linhas terapêuticas

músculo liso cavernoso endotélio Alterações estruturais e ultrastruturais nos componentes fibroelásticos das: trabéculas penianas, músculo liso cavernoso endotélio inadequada expansão sinusoidal rigidez do pénis erecto

Farmacologia para melhorar a erecção peniana Medicamentos de acção periférica de actuação predominantemente vasoactiva como os inibidores da fosfodiesterase tipo 5 Viagra

Angiogénese terapêutica 1 dos factores responsáveis pela disfunção eréctil Disfunção endotelial Traduz-se em: desordens do fluxo arterial relaxamento do músculo liso cavernoso disfunção venooclusiva Alvo farmacológico válido na prevenção da disfunção eréctil

Neovascularização cavernosa é controlada por factores de crescimento angiogénicos que promovem a proliferação e migração de células endoteliais e musculares lisas VEGF um dos factores mais importantes, que ainda estimula a produção de óxido nítrico

VEGF Família de proteínas que actuam sobre células endoteliais, estimulando a angiogénese Parente distante do factor de crescimento derivado de plaquetas (PDGF) Compreende 5 membros: VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D e factor de crescimento da placenta (codificados por genes distintos) Produzido em vários tipos de células vasculares (endoteliais, musculares lisas e fibroblastos)

regeneração de células endoteliais delineando as trabéculas cavernosas A administração intracavernosa de VEGF em modelo animal estimula a expressão da síntase de óxido nítrico endotelial, sendo a presença deste necessária para a angiogénese regeneração de células endoteliais delineando as trabéculas cavernosas Melhoramento da erecção peniana (numa situação de oclusão arterial aguda)

Utilização de modelos animais O estudo da expressão de VEGF no animal experimental parece fundamental na regulação destes mecanismos Possibilidade de manipulação biológica, química e genética, simulando nestes animais os factores de risco para a disfunção eréctil, o que permite o seu estudo in vivo  Extrapolações têm que ser cuidadosas

Imunocitoquímica Produto da reacção Anticorpo secundário conjugado com uma enzima Anticorpo primário Célula com antigénio

Protocolo Imunocitoquímica: 1º Dia Desparafinar em xilol e hidratar em etanol e água Inibir a peroxidase endógena à temperatura ambiente (TA). Recuperação antigénica em tampão de citrato Enxugar lâminas e isolar cortes com Dako pen. Adicionar tampão de incubação (5% NGS em PBS) Adicionar Anticorpo primário (1/100) “overnight” a 4ºC

Protocolo Imunocitoquímica: 2º Dia Adicionar Ab secundário (1/100) a TA Adicionar complexo Avidina-Biotina (ABC) a TA. Preparar DAB a 30% H202 e adicionar aos cortes. Parar reacção com H2O e corar com hematoxilina Desidratar e montar com Entellan

Fig. 4 Corte de pénis de rato (AT= 40x) Resultados Fig. 4 Corte de pénis de rato (AT= 40x)

Fig. 5 Corte de pénis de rato (AT= 40x)

Fig. 6 Corte de pénis de rato (AT= 40x)

Fig. 7 Corte de pénis de rato – corpo cavernoso (AT= 200x)

Discussão dos resultados Os corpos cavernosos apresentam marcação preferencial no tecido conjuntivo (sem definição específica). Este tecido apresenta as condições necessárias para a formação de vasos. O tecido muscular liso não apresenta marcação acentuada O endotélio apresenta alguma marcação. Uretra com marcação, mas no lúmen  contaminação (deficiência de lavagem)

Perspectivas futuras Estudos experimentais Fisiopatologia da erecção Mecanismos de actuação terapêutica

Agradecimentos Dr. Pedro Vendeira Dr. Jorge Ferreira Dra. Delminda Neves Serviço de Biologia Celular e Molecular

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