Expressão Gênica: Princípios e Aplicações Rodrigo A. Panepucci

Como estudar tamanha complexidade, de forma abrangente ? Genoma Humano: 30 a 60 mil genes 3 bilhões pb 23 pares cromossômicos (50~300 milhões pb cada) Como estudar tamanha complexidade, de forma abrangente ?

RNA mensageiro

Estrutura Gênica Proximal Promoter Element (TFBS) TATA box Exon Regiões Regulatórias Região Codante -10 to –50 kb -200 -30 +10 to +50 kb RNA Transcrição mRNA Proximal Promoter Element (TFBS) TATA box Exon Enhancer or UAS Intron

DNA e RNA

Hibridização de Ácidos Nucléicos

Northern Blotting RNA isolation Probe labeling Gel electophoresis AAAAAA Probe labeling pBS-SemaIII dATP dGTP dTTP dCTP Gel electophoresis Hybridization Blotting Autoradiography Northern blotting allows easy and more or less quantitative detection of a limited number of transcripts. Total RNA (or mRNA) is separated on an agarose gel and transferred to a nylon membrane. This membrane is then incubated with a radiolabeled probe derived from the gene of interest. After hybridization, size and amount of the corresponding transcript in the RNA pool are revealed by autoradiography. The method is not very sensitive.

Reverse Northern Blotting Reverse Northern blotting is the opposite of Northern blotting. Here, specific probes are immobilized on a nylon membrane and subsequently hybridized to radiolabeled cDNA derived a pool of mRNA. Multiple identical membranes can be hybridized with different cDNA pools, and the relative intensity of the hybridization signal for each spot will reveal the extent of regulation of the corresponding transcripts. This method depends has evolved into the modern cDNA macro and micro array techniques.

Macro-Arrays Densidade baixa Membranas Sondas radioativas Baixa sensitividade Spots de cDNA Barato $ cDNA arrays were discussed in detail by Sabine Spijker.

Micro-Arrays Alta densidade Laminas de Vidro Sondas fluorescentes Alta sensitividade Spots com cDNA ou Oligonucleotideos Caro $$$ cDNA arrays were discussed in detail by Sabine Spijker.

Spots

Hibridização

Quantificando a Expressão Gênica

Abordagem Experimental Célula ou Tecido Normal Neoplásico Célula ou Tecido Indiferenciado Diferenciado A1x A1y A2x A2y A3x A3y Duplicatas A1 A2 A3 x y Amostras B1x B1y B2x B2y B3x B3y Duplicatas B1 B2 B3 x y Amostras

Plataforma CodeLink

Plataforma CodeLink RNA total Estreptavidina Biotina RNA bacteriano Estreptavidina Biotina (controle) Transcrição reversa AAAAA TTTTT - T7 Síntese da segunda fita de cDNA Conjugado TTTTT - T7 T7 RNA polimerase e rNTPs biotinilados TTTTT cRNA Biotina Fragmentação & cRNA Hibridização Detecção Sondas Matriz em gel

Microarrays de oligonucleotídeos (CodeLink Human UniSet I) ~ 10.000 Genes

Aplicações Pesquisa Básica (Biologia do Câncer) Alvos terapêuticos Marcadores Diagnósticos Marcadores Prognósticos Mecanismo de ação de drogas

Linfoma de Células do Manto

(Linfócitos B virgens) Adaptado: Delves & Roitt. NEJM 343:108, 2000 Origem Celular Zona do manto Centro germinativo Zona marginal (Linfócitos B virgens) Adaptado: Delves & Roitt. NEJM 343:108, 2000

Translocação t(11;14)(q13;q32) Patogênese molecular Translocação t(11;14)(q13;q32) 14q32 Ig Cµ 11q13 Ciclina D1

Amostras de células isoladas com Objetivo Linfoma de células do manto Linfócito B virgem X Amostras de células isoladas com elevado grau de pureza Microarrays Vias alteradas (Alvos Terapeuticos)

Diferencialmente Expressos Genes Diferencialmente Expressos MCL NBC MCL NBC Validação MCL (PB) - 21 MCL (pure) – 6 NBC - 4 Screening MCL – 3 Vs NBC - 3

Redes de Associação Biológicas (Pathway Studio) Ariadne Genomics http://www.ariadnegenomics.com/

MedScan

MedScan

Interpretação das Redes de Associação Biológicas Ariadne Genomics http://www.ariadnegenomics.com/

Identificação de Vias de Sinalização Ariadne Genomics http://www.ariadnegenomics.com/

Vias de Sinalização Alteradas no Linfoma de Células do Manto Genes relacionados à apoptose Via PI3K/AKT (Fosfatidilinositol-3-quinase-AKT) Via WNT Via TGFβ (Fator de crescimento tumoral β)

Via de sinalização PI3K/AKT PDK1 PDK2 AKT AKT AKT P P Thr308 Thr308 PIK3CA Ser473 P Ser473 PIK3R1 P p85 p110 Alvos celulares PIP AKT 2 PIP 3 Adaptado: Vivanco & Sawyers. Nat Rev Cancer 2:489, 2002

Aplicações Pesquisa Básica (Biologia do Câncer) Alvos terapêuticos Marcadores Diagnósticos Marcadores Prognósticos Mecanismo de ação de drogas

AKTion on Mantle Cell Lymphoma Gold, M. R. Blood 2006;108:1425-1426 Copyright ©2006 American Society of Hematology. Copyright restrictions may apply.

Linfoma de células do manto

Aplicações Pesquisa Básica (Biologia do Câncer) Alvos terapêuticos Marcadores Diagnósticos Marcadores Prognósticos Mecanismo de ação de drogas

Mecanismo de ação de drogas Ação in-vitro do inibidor da via TGF-B (Halofuginona), na linhagem GRANTA de Linfoma da Zona do Manto Efeito in-vivo da droga Hidroxyurea na Anemia Falciforme

Aplicações Pesquisa Básica (Biologia do Câncer) Alvos terapêuticos Marcadores Diagnósticos Marcadores Prognósticos Mecanismo de ação de drogas

LLA Pediátrico Diagnostico: Baixo Risco Baixo Risco Quimioterapia Reavaliação: Baixo Risco Alto Risco

Avaliação da expressão gênica ao diagnóstico Expressão Gênica e Risco Associado Diagnóstico: Baixo Risco Baixo Risco Reavaliação: Baixo Risco Alto Risco Avaliação da expressão gênica ao diagnóstico Agrupamento baseado na reavaliação

SERP1 - 25 ALL children (14 good responders vs 11 poor responders) Expressão Gênica e Marcadores Diagnóstico: Baixo Risco Baixo Risco Reavaliação: Baixo Risco Alto Risco Marcadores de Prognóstico ou Diagnóstico Diferencial SERP1 - 25 ALL children (14 good responders vs 11 poor responders)

Bases Moleculares do Risco Diagnóstico: Baixo Risco Baixo Risco Reavaliação: Baixo Risco Alto Risco Anti-Apoptóticos ? Proliferação ? Resistência a Drogas ?

Bases Moleculares do Risco Diagnóstico: Baixo Risco Baixo Risco Reavaliação: Baixo Risco Alto Risco Pró-Apoptóticos ? Anti-Proliferação ?

Bases Moleculares da Mudança de Risco Anti-Apoptóticos Pró-Apoptóticos

Aplicações Pesquisa Básica (Biologia de Células Tronco) Alvos terapêuticos Marcadores Diagnósticos Marcadores Prognósticos Mecanismo de ação de drogas

Células Tronco Hematopoéticas CD34+ & CD133+

Redes Transcricionais Células CD133+ Uma sub-população mais primitiva dentre as CD34+ (Potencial endotelial)

Experimental Design 1 & 2 = Pooled Samples A & B = Individual Samples BM UCB BM UCB CD34 Vs CD133 1 & 2 = Pooled Samples A & B = Individual Samples CodeLink Human UniSet I (~10.000 genes)

Comparison of gene expression profiles between CD133+ and CD34+ from BM & UCB cells Vs CD133+ (BM&UCB) CD34+ (BM&UCB) 891 Up-Regulated in CD133+ 375 Down-Regulated in CD133+

Transcription Factors Over-Represented in CD133 cells Name Description CTNNA2 catenin (cadherin-associated protein), alpha 2 DLX2 distal-less homeo box 2 E4F1 E4F transcription factor 1 EP300 E1A binding protein p300 FOXG1B forkhead box G1B GATA3 GATA binding protein 3 HMGA1 high mobility group AT-hook 1 HOXA9 homeo box A9 HOXB4 homeo box B4 HOXC6 homeo box C6 JUND jun D proto-oncogene KLF2 Kruppel-like factor 2 (lung) MEF2D MADS box transcription enhancer factor 2, polypeptide D (myocyte enhancer factor 2D) PAX5 paired box gene 5 (B-cell lineage specific activator) PAX6 paired box gene 6 (aniridia, keratitis) PML promyelocytic leukemia RUNX1 runt-related transcription factor 1 (acute myeloid leukemia 1; aml1 oncogene) SRF serum response factor TAL1 T-cell acute lymphocytic leukemia 1 USF1 upstream transcription factor 1 47 Differentially Expressed Transcription Factors Hemato- Endothelial Related

Higher Expression of GATA3 in CD133+ Cells Mann-Whitney Test

Complexo Transcricional e Fatores de Transcrição (TF)

Complexo Transcricional e Fatores de Transcrição (TF)

Fatores de Transcrição (TFs) Zinc Finger

Sítios de Ligação de TFs Uma matriz de freqüência (PWM) para um Fator de Transcrição pode ser construída a partir de um conjunto de sítios de ligação determinados empiricamente. 123456789…… AAGTTAATGACTAAC CGGTTAATGAGAACC AGGTTAATGAGAACC AAGTTAATGATTGAC CAGTTAATGATTGAC AGGTTAATGACTAAC GGGTTAATGACTAAC ACGTTAATGACTAAC GTGTTAATGACTAAC GAGTTAATGACTAAC CAGTTAATGACTAAC ATGTTAATGACTAAC Pos 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 A 14 16 4 0 1 19 20 1 4 13 4 4 13 12 3 C 3 0 0 0 0 0 0 0 7 3 1 0 3 1 12 G 4 3 17 0 0 2 0 0 9 1 3 0 5 2 2 T 0 2 0 21 20 0 1 20 1 4 13 17 0 6 4 Representação Esquemática

Promoter Analysis Transcription Element Listening System (TELIS) 600bp Upstream Promoters of 44 Differentially Expressed Transcription Factors Highly Stringent TF-BS Search Statistically Significant (Top 3) V$NFKAPPAB_01 V$NFKAPPAB65_01 V$CREL_01

Overrepresented NFB Biding Sites and TF Genes Potentially Up-Regulated by NFB in CD133+ cells Frequency Number of binding sites per promoter   Incidence % of promoters with at least one binding site 1.    V$NFKAPPAB_01 z = 4.37  p = 1.25E-5 Sample mean = 0.114 Population mean = 0.020 Ratio = 5.8       n = 4/44  p = 0.0097 Sample mean = 9.09% Population mean = 1.90% Ratio = 4.8 2.    V$NFKAPPAB65_01 z = 4.10  p = 4.10E-5 Sample mean = 0.114 Population mean = 0.022 Ratio = 5.2       n = 5/44  p = 0.0025 Sample mean = 11.36% Population mean = 2.15% Ratio = 5.3 3.    V$CREL_01 z = 3.07  p = 0.0022 Sample mean = 0.182 Population mean = 0.063 Ratio = 2.9       n = 7/44  p = 0.0149 Sample mean = 15.91% Population mean = 5.98% Ratio = 2.7

O Fator Transcricional NF-B NFKB1 NFKB2 RelA p50 p65 Chen et al, 1998, Nature, Vol 391 -N 22

Non-Canonical NFB Sub-units on Higher Expression of Non-Canonical NFB Sub-units on CD133+ HSC Compared to CD34+ NFB2 RELB P = 0.0247 P = 0.0944 Mann-Whitney Test

Correlation of NFB2 and RELB Levels in HSC RELB & NFKB2 0 to 2 TF Binding Sites P = 0.0002 Spearman’s Correlation (r = 0.6028)

Correlation of NFKB2 and GATA3 Spearman Correlation (r = 0.5415) in HSC Correlation GATA3 BM CD133+ 0 to 2 TF Binding Sites P = 0.0008 Spearman Correlation (r = 0.5415)

Correlation of RELB and GATA3 in HSC Correlation GATA3 & RELB 0 to 2 TF Binding Sites P = 0.0013 Spearman’s Correlation (r = 0.4995)

Effect of NFKB2 RNAi Inhibition on RELB and GATA3 Levels NFKB2 Inhibition