SEPARAÇÃO DE PROTEINAS POR CROMATOGRAFIA 1. Princípio geral da cromatografia a.matriz sólida capaz de reter a molécula alvo b.passagem (forçada ou não) do fluido contendo a molécula alvo através da matriz c.retenção da molécula alvo por certo tempo d.eluição separada dos componentes do fluido e, consequentemente da molécula alvo

Cromatograma e algumas variáveis características Resolução cromatográfica: (trB – trA) 0,5 (WbA + WbB) RS =

- Eficiência da purificação é avaliada pela resolução cromatográfica (RS). RS = (trB – trA) / 0,5 (WbA + WbB) RS < 1 => separação incompleta RS = 1 => curvas se tocam na base RS > 1 => separação completa * Normalmente a matriz é empacotada numa coluna (leito fixo) ** Variante: adsorção em leito fluidizado. Neste caso há movimento da matriz

2. Tipos de cromatografia (quanto à retenção e liberação da molécula, em leito fixo) 2.1 Troca iônica - retenção baseada na carga da superfície da proteina/molécula - mais comum, de grande aplicabilidade (resinas têm alta capacidade de adsorver proteínas) - Tem boa seletividade - Separa a proteina das impurezas - A molécula alvo é eluída com íons de mesma carga que esta, porém com maior força de interação com a fase estacionária

- A capacidade total de um trocador é dada pela quantidade de grupos carregados na fase móvel que podem ser trocados por unidade de volume ou massa de matriz. - Ampliação de escala: aumento do volume da coluna (normalmente pelo aumento do seu diâmetro). Critério: velocidade superficial da fase líquida (vazão/área da seção da coluna) Obs.: manter constantes todas as demais variáveis

2.2 Gel filtração - Separação por tamanho (volume efetivo) da molécula - Moléculas com volume efetivo maior que o poro são expulsas da coluna no volume espacial (Ve) - Moléculas menores penetram nos poros e em seguida são arrastadas pelo eluente - A separação obedece a sequência de volume efetivo 2.3 Cromatografia hidrofóbica - Retenção da molécula pela interação da sua região hidrofóbica com a matriz - A proteína é colocada num meio com alta concentração de sal

- A eluição é feita com um eluente de baixa concentração de sal ou aumentando-se o conteúdo de solvente orgânico - O gel é mais caro que a resina de troca iônica porém mais barato que as matrizes de afinidade 2.4 Focalização isoelétrica - Retenção ocorre num tipo especial de resina de troca iônica que contem grupos químicos que conferem um gradiente de pH - A eluição é feita com um fluido que contem um anfólito especialmente formulado

- Permite separar isoproteínas (excelente reso-lução) - Gel e eluente são caros aplicação nos estágios finais da purificação de produtos de alto valor agregado 2.5 Afinidade - A matriz é formada por um ligante bioespecífico e seletivo

O complexo formado entre o ligante e a proteína tem que ser reversível A molécula alvo é retida e as impurezas são eliminadas Finalmente a proteína é eluída e o ligante regenerado 2.6 Fase reversa - Compreende uma fase estacionária apolar e uma fase móvel de polaridade moderada. - Quanto mais apolar for a molécula alvo maior será o seu tempo de retenção (e vice-versa). - Alterando-se as forças de interação entre as fases móvel e estacionária, promove-se a eluição da molécula alvo. Isto possibilita também regular o seu tempo de retenção.

3. Cromatografia em leito fluidizado Baseia-se na movimentação da matriz Útil para purificar proteínas de soluções contendo ou não material particulado (células suspensas ou fragmentos), uma vez que permite integrar as etapas de clarificação e purificação grande interesse

Ideal para os casos em que não se aplica o sistema de leito empacotado e para reduzir perda por ação de proteases (redução de tempo) Por exemplo, proteínas heterólogas sintetizadas por E. coli estão frequentemente num meio que apresenta elevada viscosidade e contem fragmentos da parede da bactéria, características que o tornam inadequado para uma centrifugação e cromatografia em leito empacotado.

Os ligantes clássicos SP – sulfapropil, DEAE – dietil aminoetil – e IDA – ácido iminodiacético - para adsorção por troca iônica, IgG - para adsorção por afinidade e Streamline Phenyl - para adsorção por hidrofobicidade, são acoplados ao suporte das partículas adsorventes (agarose-quartzo ou agarose-metal) elevando sua densidade, e viabilizando a expansão do leito

Tipos de reatores contendo o meio adsorvente suspenso: Reator agitado (mais simples) Processo clássico é o CARE (“Continuous Adsorption Recycle Extraction”) Reator expandido

Características dos fluidos F1 (sup.) = solução tampão contendo a molécula alvo, sob condições favoráveis à adsorção F1 (inf.) = descarte - fase líquida rica em conta-minantes e pobre em molécula alvo F2 (sup.) = alimentação do tampão de eluição F2 (inf.) = solução rica em molécula alvo F3 (dir.) = suspensão do adsorvente, rico em molécula alvo, que alimenta o segundo reator F3 (esq.) = suspensão do adsorvente reciclado do segundo reator

Reator expandido Analisar F1, F2 e F3 sob ponto de vista de vazão O material adsorvente (sólido) tem uma densidade maior que a do líquido (eluente) que, por ser aplicado a uma velocidade superficial adequada, faz com que o leito sofra expansão

Reator expandido Analisar F1, F2 e F3 sob ponto de vista de vazão O material adsorvente (sólido) tem uma densidade maior que a do líquido (eluente) que, por ser aplicado a uma velocidade superficial adequada, faz com que o leito sofra expansão

Esquema ilustrativo das etapas da adsorção em leito expandido.

Variáveis importantes (para Leito expandido) A expansão do leito e os fatores a ela associados interferem na ligação proteína-adsorvente Velocidade superficial do fluido (U), velocidade terminal da partícula (UT), porosidade () e índice de expansão (n) do leito

n é função do número de Reynolds A velocidade superficial do fluido (U), também chamada de velocidade linear, é definida por: Onde Q é a vazão de alimentação do leito (m3/h) e A é a área da seção transversal da coluna (m2).

A velocidade linear varia entre 100 e 300 cm/h nas operações de expansão, aplicação do meio e lavagem. Na operação de eluição a velocidade linear é reduzida para cerca de 100 cm/h, o que eleva a concentração da molécula alvo no eluído. Outras variáveis: - Grau de expansão do leito (GE = H/Ho) H: altura do leito expandido Ho: altura do leito em repouso valores típicos de GE: 2 a 3 - Número de pratos teóricos - Distribuição do tempo de residência

Dimensionamento para Cromatografia convencional Variáveis envolvidas: Número de colunas (Nco) Produção diária (Q) Capacidade da coluna por ciclo (Md) Número de ciclos por dia (Nci) Q Nco = Md . Nci

Considerando algumas situações limitantes do processo, pode-se chegar à expressão: 53050 . Q Nco = D2 . V . P Onde D é o diâmetro da coluna, V é a velocidade do fluido na saída e P é a concentração de proteína no eluído.

Purificação de pro-insulina por cromatografia de afinidade

Cromatograma e algumas variáveis características

Reator agitado Solução com molécula alvo Fase rica em contaminantes

Reator agitado Solução com molécula alvo Tampão de eluição Fase rica em molécula alvo Fase rica em contaminantes

Reator agitado Solução com molécula alvo Tampão de eluição Fase rica em molécula alvo Fase rica em contaminantes Adsorvente com molécula alvo Adsorvente sem molécula alvo