DISCUSSÃO DOS RESULTADOS BIOPROSPECÇÃO DE POLISSACARÍDEOS DA BIOMASSA DO Lecanicillium lecanii COM ATIVIDADE ANTIMICROBIANA Diego Tadeu Degli Exposti 1*, Maria de Lourdes Corradi da Silva, Ana Flora Dalberto Vasconcelos, Samara Marrye Aguiar Alexandre, Gabriel Aranda-Selverio Faculdade de Ciências e Tecnologia/UNESP - campus de Presidente Prudente – Departamento de Física, Química e Biologia – 1FAPESP (2010/05567-0) - *diegodegli@hotmail.com INTRODUÇÃO DISCUSSÃO DOS RESULTADOS Os fungos apresentam potencial de aplicação na área ambiental como detoxicadores de compostos e nas diferentes áreas industriais, como em alimentos, cosméticos e medicamentos. A aplicação desses microrganismos pode ser através de macromoléculas produzidas e excretadas ou do isolamento de componentes celulares da biomassa fúngica que podem apresentar propriedades específicas de interesse biotecnológico e de grande valor agregado. Fig. 1: Aplicação nas indústrias (a) alimentícia, (b) cosmética, (c) farmacêutica e (d) como detoxicadores de compostos. O Lecanicillium lecanii tem sido utilizado como inseticida biológico, pois produz enzimas que degradam a cutícula de insetos. Apesar de haver na literatura informações sobre substâncias produzidas por este microrganismo, pouco ou nada se sabe a respeito de sua biomassa, principalmente em relação aos polissacarídeos que são responsáveis por cerca de 80 a 90 % da matéria seca, presente na parede celular de fungos. Para compreender o metabolismo desse microrganismo em relação a produção e a excreção dessa toxina com ação inseticida, o conhecimento dos componentes carboidratos da biomassa deve ser investigado. O teor de açúcares totais, obtido pelo método de Dubois [2], nos extratos aquosos e alcalinos foi de 95% e 73%, respectivamente. Foram encontrados 5% e 27% de proteína, respectivamente, pelo método de Bradford [3]. Apenas os extratos alcalinos foram selecionados para dar continuidade ao trabalho, uma vez que este procedimento de extração decompõe integralmente a célula expondos todos os seus constituintes, inclusive seus polissacarídeos. (a) (b) (c) (d) Configuração β Configuração α Fig. 3: Perfil cromatográfico de filtração em gel Sepharose CL-6B do precipitado etanólico do extrato alcalino. Vol. coluna: 200 mL; Material aplicado 10 mg; Fluxo: 1,2 mL/min; Vol. fração: 2,5 mL; Vol. morto: 65 mL. Fig. 4: Espectros no FT-IR das frações P I, P II, P III e P IV. Material aplicado: 0,8 mg; pastilhas de KBr; pressão: 60 KN; tempo: 180 s; resolução: 4 cm-1. OBJETIVOS Extrair e isolar os polissacarídeos da biomassa do ascomiceto Lecanicillium lecanii para que se possam realizar estudos de caracterização molecular e ensaios de atividade biológica, tais como bactericida. METODOLOGIA O microrganismo Lecanicillium lecanii foi cultivado em condições para proporcionar quantidade significativa de biomassa utilizando meio mínimo de sais de Vogel [1] acrescido de sacarose (50 g/L) como fonte única de carbono. Quantificações de açúcares totais e proteínas FTIR HPAEC/PAD HPSEC/RID (c) (a) (b) Fig. 5: Perfis de eluição das frações (a) P I, (b) P II, (c) P III e (d) P IV por HPSEC/RID. Colunas de gel permeação dispostas em série, com limites de exclusão de 1.106, 4.105, 8.104 e 5.103 Da. Material aplicado: 200 µg em 200 µL; fluxo: 0,6 mL/min. Eluente: NaNO3 0,1 M contendo azida sódica 0,03%, pressão de 1422 psi a 37 ºC. Fig. 2: Biomassa do Lecanicillium lecanii (a) após interrupção do cultivo, (b) seco em estufa a 50°C e (c) submetida à extrações distintas. Tabela 1: Composição percentual em açúcares totais obtida pelo método de Dubois, e em monossacarídeos após hidrólise ácida das frações PI, PII, PIII e PIV obtida por HPAEC/PAD. Fração P IV Fracionamento por cromatografia de filtração em gel Sepharose CL-6B Sobrenadante do Gelo/Degelo precipitado em etanol (0,73 g) Precipitado do Gelo/Degelo* (1,3 g) Fração P I Fração P III Fração P II Extração (KOH(aq.) a 2% m/v, 100°C, 2 h, 2x) Precipitação com EtOH Tratamentos consecutivos de purificação por congelamento/descongelamento Ppt. Etanólico do Ext. Alcalino (2,1 g) Sobrenadante Etanólico* Resíduo* (2,4 g) Ext. Alcalino Extração (H2O, 100°C, 4 h, 4x) Extração (etanol, 78°C, 2 h) Biomassa do Lecanicillium lecanii (16,4 g) Resíduo (12,6 g) Ext. Etanólico* (3,7 g) Resíduo (6,7 g) Ext. Aquoso* Frações Açúcar Total (%) Galactose (%) Glucose (%) P I 100,0 47,0 53,0 P II 99,0 P III 91,0 55,0 45,0 P IV 52,0 48,0 CONCLUSÃO A biomassa de Lecanicillium lecanii forneceu por extração alcalina, seguida de procedimentos de purificação, uma glucogalactana homogênea com configurações α e β (P IV) que terá sua estrutura química fina determinada para estudos posteriores de atividade biológica. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS [1] Vogel, H. J., A convenient growth medium for Neurospora crassa. Genet. Bull., 1956, 13, 42–43. [2] Dubois, N.; Gilles, K. A.; Hamilton, J. K.; Rebers, P. A.; Smith, F., Anal. Chem., 1956, 28, 350-356. [3] Bradford, M. M., Anal. Biochem., 1976, 72, 248-254. AGRADECIMENTOS * Material não investigado. Diego T. Degli Exposti – IC/FAPESP (2010/05567-0) Fluxograma: Esquema de extração dos polissacarídeos da biomassa do Lecanicillium lecanii.