Validação de métodos analíticos em toxicologia

Validar Por que validar? VALIDAR um método analítico é estar com o objetivo voltado para a confiabilidade analítica do método escolhido ou desenvolvido para se obter o resultado. A validação de um método é um dos elementos básicos de sistemas de qualidade de laboratórios: - BPL (Boas Práticas de Laboratório)-GLP - ISO17025 Por que validar? A validação visa diminuir ou controlar os fatores que levam a imprecisão ou inexatidão de um dado gerado.

Erros sistemáticos: São erros que a princípio pode-se “aliviá-los nas medidas”, ou seja, eliminá-los ou aplicar fatores de correção, desde que constantes. Ex: erros instrumentais, erros devido à presença de impurezas, erros de operação, erros pessoais, erros de método. Erros indeterminados: São erros devido a variações ao acaso, de causas não conhecidas exatamente, em geral irregulares e pequenas e de difícil controle do operador como: umidade, temperatura, iluminação, etc.

Parâmetros avaliados em validação de métodos Precisão Exatidão Linearidade Recuperação Limite de detecção (LOD) e limite de quantificação (LOQ) Especificidade Robustez Estabilidade do analito

Precisão A precisão é o parâmetro que avalia a proximidade entre várias medidas efetuadas em uma mesma amostra. A medida de precisão deve levar em conta: condições de repetibilidade e/ou reprodutibilidade Condições de repetibilidade: são condições em que resultados independentes são obtidos usando: -o mesmo método; -para a mesma amostra; -o mesmo operador; -o mesmo laboratório; -usando o mesmo equipamento; -em um curto intervalo de tempo

Condições de reprodutiblidade: são condições onde resultados são obtidos usando: -o mesmo método; -para a mesma amostra; -em diferentes laboratórios; -por diferentes operadores; -usando equipamentos diferentes. Exatidão A exatidão é a diferença entre o valor real presente na amostra e o valor obtido na análise. É avaliada através da inexatidão, ou seja, o afastamento entre os valores esperado e obtido.

Exatidão x precisão

Linearidade A linearidade é a capacidade de um método analítico gerar resultados proporcionais à concentração da espécie em análise, dentro de uma faixa analítica especificada. A linearidade é determinada pela análise de uma série de calibradores (amostras adicionadas com diversas concentrações conhecidas do analito), abrangendo a faixa de concentração de interesse no trabalho. Com essas análises realiza-se a curva de calibração.

Recuperação A recuperação avalia a eficiência do método de tratamento da amostra. Toda amostra que recebe tratamento de análise indireta (extração) deve ter calculado experimentalmente a perda do analito decorrente desse tratamento. A recuperação expressa a variação de resposta obtida entre a quantidade de analito adicionada antes da extração e aquela decorrente da adição da mesma quantidade do analito após o processo de extração.

LIMITE DE DETECÇÃO E DE QUANTIFICAÇÃO Limite de detecção (LOD) é a menor concentração ou quantidade de uma substância (analito) que pode ser identificada por um método analítico com um nível de confiança especificado ou ainda, que pode ser estatisticamente diferenciada do ruído. Limite de quantificação (LOQ) é a menor concentração do analito que pode ser quantificada com uma precisão especificada.

Sensibilidade SELETIVIDADE E ESPECIFICIDADE A sensibilidade de um método indica sua capacidade de discriminar, com uma fidelidade estabelecida, concentrações próximas de um analito. Sensibilidade ≠ LOD SELETIVIDADE E ESPECIFICIDADE A seletividade corresponde à capacidade de um método em determinar o analito na presença de outras substâncias prováveis de interferirem na determinação. O termo especificidade se refere a um método específico para um único analito, enquanto seletividade diz respeito a um método que permite a análise de várias substâncias que podem ou não ser distinguíveis.

Robustez Estabilidade A robustez é a capacidade do resultado de um método permanecer inalterado por pequenas mudanças de parâmetros operacionais e ambientais, como temperatura do ambiente, pH, concentração da fase móvel (HPLC), materiais de diferentes procedências etc. Estabilidade A estabilidade da substância em teste poderá ser feita em relação a matriz de trabalho nas seguintes condições: Durante armazenamento -temperatura ambiente -temperatura de geladeira (4°C) -temperatura de congelamento (-20°C) Ciclos de congelamento e descongelamento (3ciclos) Após a extração