AX, PARDINI INFECÇÕES BACTERIANAS IMUNODIAGNÓSTICO da SÍFILIS Profa. Alessandra Pardini

IMUNODIAGNÓSTICO DAS INFECÇÕES BACTERIANAS Infecção Bacteriana: tempo para resposta imune X tempo para ação patogênica Diagnóstico Microbiológico é confirmatório e permite antibiogramas (demorado) ‏ 1 - TOXINAS 2 - CÁPSULAS 3 - INTRACELULAR

BACTÉRIAS INTRACELULARES Mycobacterium tuberculosis, M. leprae: tuberculose e hanseníase. Testes Intradérmicos de Hipersensibilidade tardia (formação de nódulo/pápula com ou sem eritema em horas). Pouca ou nenhuma resposta humoral Lysteria monocytogenes, Brucella abortus: conjuntivites e infecção intra- uterina. Fonte de infecção animais (suínos e bovinos). Difícil isolamento microbiológico. Testes Imunológicos para detecção de anticorpos. Salmonella typhi, S. paratyphi A, B. Antígeno flagelar (H) - proteínas. Anticorpos protetores IgG Antígeno somático (O) - polissacarídeos. Anticorpos IgM Antígeno Vi(multiplicação) - polissacarídeos. Anticorpos IgM persistentes Infecção Recente: Ac anti-O e anti-Vi Infecção Pregressa ou vacina: anti-H com ou sem anti-Vi Portador crônico: anti-O e anti-Vi

BACTÉRIAS TOXIGÊNICAS Único Fator de Virulência: Clostrideos (C. tetani, C. botulinum, C. perfingens, C. diphtheriae) ‏ Testes Imunológicos para estudo e produção de soros e vacinas) ‏ Anticorpos neutralizantes de toxinas (Soroterapia e após imunização com toxóides) ‏ C. diphtheriae: Teste de SCHICK. Inóculo da toxina, se houver Ac neutraliza a ação necrosante da toxina Vibrio cholerae: imunizar grupos de risco Também há testes imunológicos que detectam e quantificam as toxinas (usam anticorpos poli- e monoclonais) ‏

Principal Fator de Virulência: Bordetella pertussis: vacinas e soros Staphylococcus aureus: não produz imunidade protetora Streptococcus beta hemolítico: grupos A (mais importante), B, C, D, F, G Enzimas degradadoras: hialuronidase, estreptoquinase, DNAse, NADse, Polissacaride A. Grupo A: toxinas O, S (citopáticas e inibem macrófagos) ‏ Anti-SLO = ASLO (streptolisina O): anticorpos produzidos na vigência de infecções crônicas. ASLO (por semelhança antigênica?) pode ligar-se a fibras do sarcolema cardíaco, induzindo auto-imunidade (febre reumática) ‏ Imunocomplexos SLO-ASLO podem depositar-se no endotélio dos glomérulos e por hipersensibilidade tipo III (citotoxicidade mediada por imunocomplexos) causar glomerulonefrites Controle do nível de ASLO para evitar essas consequências Dosagem de ASLO: nefelometria ou inibição de imuno-hemólise SLO lisa hemácias de carneiro. ASLO inibe essa ação.

DIAGNÓSTICO IMUNOLÓGICO DA SÍFILIS

- causada pelo Treponema pallidum (Ordem Spirochaetales, Família Treponemataceae) ‏ - Espiroquetas delicadas (5-15m x 0,09-0,20m), 6-24 espirais (média 14) ‏ - Corpo envolvido por duas membranas entre as quais se enrola um filamento helicoidal fibrilar, inserido nas extremidades (filamento axial) ‏ - Motilidade: contração das espirais para frente e para trás com rotação contínua - Não cultiváveis. Mantido por inoculação em testículo de coelho - Constituintes externos, envelope (específicos): proteínas, lipídeos e poliosídeos - Parede celular: ácido murâmico, glicosamina e ornitina - Membrana citoplasmática: proteínas e fosfolípides (inespecíficos) ‏

AX, PARDINI Transmissão - contato direto com pele, mucosa ou tecidos íntegro ou lesados - sexual - parenteral - vertical - inoculação cancro mole (Haemophilus ducreyi) ‏ Cancro duro: ulceração indolor, de bordas endurecidas acompanhada de linfadenopatia regional.

AX, PARDINI Patogenia - T. pallidum é invasivo - A resposta celular local forma o cancro ou proto-sifiloma - Os treponemas, via linfática, alcançam a corrente s angüínea - Resposta imune-inflamatória lenta e progressiva: lesões teciduais Imunidade na sífilis pode variar de acordo com as fases da infecção

AX, PARDINI Resposta Humoral: Ac (IgG, IgM, IgA, IgE) específicos (inclusive imobilizadores) e inespecíficos, imunidade passiva em experimentos animais, resistência parcial à reinfecção. Resposta Celular: lesões do tipo hipersensibilidade tardia Fatores Supressores: material mucopolissacarídico da cápsula do T. pallidum, observação experimental. Cicatrização Espontânea: Ac, ly e mucopolissacaridase bloqueando adesão do treponema aos tecidos + processo inflamatório. FASESE CLÍNICAS EVOLUTIVAS - crônica em quatro estágios distintos - flutuação entre sintomática (curtos) e assintomática (longos) ‏

AX, PARDINI SÍFILIS PRIMÁRIA T. pallidum penetra no hospedeiro através da mucosa íntegra multiplica-se - vasos linfáticos - corrente sangüínea – disseminação - após incubação de 10 a 90 dias (média 21 dias): proto-sifiloma, lesão primária (local da inoculação), geralmente única e indolor e reação ganglionar satélite - cancro: base lisa, bordas salientes, firmes e endurecidas (material mucóide com sulfatação do ácido hialurônico) a cicatrização da lesão é espontânea (resposta imune-inflamatória) em 3 a 6 semanas - Anticorpos são detectados concomitante ou até 2 semanas após o início da lesão - Isolamento e identificação: microscopia de campo escuro (S=95%) (visualização direta do espiroqueta) a resolução e cura do cancro está associada a um influxo maciço de macrófagos, ao que segue fagocitose e digestão dos organismos

AX, PARDINI SÍFILIS SECUNDÁRIA - mesmo havendo um aparente controle inicial da infecção pela imunidade humoral e celular, a doença torna-se generalizada - surge após 6-8 semanas da cura da lesão primária - lesões disseminadas (pele, mucosas, fígado, baço, rim, coração, ossos, articulações) ‏ - lesões cutâneas: papulares, maculosas, pápulo-escamosas, pustulares e nodulares (não há prurido) ‏ - manifestações clínicas: mal-estar, anorexia, cefaléia, artralgia, febre e linfadenopatia - Síndrome nefrótica moderada ou nefrite hemorrágica: deposição de imunocomplexos - pode ser isolado o Treponema: lesões, sangue, LCR, leite materno

AX, PARDINI SÍFILIS LATENTE - À medida que as lesões da sífilis secundária secundária involuem, inicia-se o estágio de latência - Anticorpos presentes e Sintomatologia ausente - Precoce (< 1-2 anos) e tardia - A fase latente precoce é considerada altamente infectante: alguns pacientes apresentam reincidência de lesões mucocutâneas - Na fase latente tardia é possível a transmissão materno-fetal e por via sangüínea - Na ausência de tratamento, os terponemas invadem o sistema nervoso central e tecidos vasculares

AX, PARDINI SÍFILIS TARDIA ou TERCIÁRIA - Não é infectante. Compromete todos os órgãos (fase destrutiva). Pode manifestar-se: - sífilis latente benigna ou gomosa: 1-10 anos após o início da infecção (15% dos pacientes não tratados) com lesões granulomatosas em olhos, ossos, viscerais (cardiovascular, fígado e SNC) e pele. Número pequeno de treponemas, sugerindo hipersensibilidade celular. - sífilis cardiovascular: após mais de dez anos de infecção (10% dos pacientes não tratados). Vasculites e aneurismas graves. neurossífilis: 3-35 anos após a infecção inicial pode haver comprometimento do SNC (8% dos pacientes não tratados). - O diagnóstico precoce pode ser feito com exames do LCR.

AX, PARDINI SÍFILIS CONGÊNITA Gestantes com sífilis não tratada, em especial na 16 a - 18 a semana. Pode manifestar-se de forma precoce, ao nascimento, semelhante à fase secundária: com lesões mucocutâneas, linfadenopatia difusa, hepatoesplenomegalia, lesões oculares, comprometimento renal e do SNC. Ou tardiamente, após 2 anos de idade: neurosífilis, surdez, comprometimento vascular, fronte olímpica, nariz em sela, tíbia em sabre, dentes de Hutchinson. Dificuldades diagnósticas: anticorpos maternos (IgG), cerca de 40% dos casos de sífilis congênita evoluem para morte (fetal, nati ou neonatal) até 75% dos casos são diagnosticados após 10 anos de idade (PNCDST/AIDS - MS, 1993): soropositividade em gestantes de 2,7 a 11,5% (lesões sifilíticas em 3,2% de placentas) ‏

AX, PARDINI TESTES SOROLÓGICOS USADOS NO DIAGNÓSTICO DA SÍFILIS Existem três tipos de métodos para auxiliar o diagnóstico laboratorial da sífilis: (a) Exame microscópico direto (ex:técnica de campo escuro) ‏ (b) Testes não treponêmicos para "screening" (testes lipoídicos ou de cardiolipina) ‏ (c) Testes treponêmicos confirmatórios

AX, PARDINI 1. Pesquisa em Campo Escuro 1) coleta do material: deve ser realizado cuidadosamente, removendo-se a camada de material que recobre a lesão; 2) encostar a lâmina meio mais definitivo de diagnóstico é feito pelo achado de espiroquetas móveis e de morfologia típica em lesões da sífilis adiquirida recente ou congênita positivo para sífilis primária, nas lesões úmidas da sífilis secundária e congênita - um único resultado negativo é insuficiente para excluir o diagnóstico porque sabões e outras coisas que os pacientes passam no cancro falseiam o resultado

- pode haver confusão devido a presença de espiroquetas, morfologicamentes indistinguíveis do T. pallidum na boca, especialmente ao redor das margens gengivais - o T. pallidum também pode ser demonstrado em biópsias ou amostras patológicas através de coloração com anticorpos fluorescentes ou coloração pela prata

Pesquisa em Campo Escuro - coleta – após remoção do material que recobre a lesão - diagnóstico - espiroquetas típicas em lesões – outras - Positivo: lesões de sífilis primária, secundária (úmidas) e congênita - Negativo: falso- negativo – sabão - Sensibilidade: 80%

AX, PARDINI 2. Testes Não Treponêmicos – Testes de Cardiolipina Venereal Disease Research Laboratory (VDRL) Rapid Plasma Reagin (RPR) ‏ - Utilizam como antígeno fosfolípide (extrato do coração de boi) são testes cujos antígenos são cardiolipina, colesterol e lecitina geralmente empregados para TRIAGEM da sífilis revelam a presença de REAGINAS (anticorpos naturais) – embora encontrem-se em quantidades diminutas, na sífilis atingem altos níveis evidenciam anticorpos chamados reaginas, presentes no soro de pessoas com sífilis e, ocasionalmente, em soros de outras pessoas com doenças agudas ou crônicas e, também, em condições fisiológicas (gravidez) fácil realização, econômicas, reprodutíveis, simples, baratos

VDRL (Veneral Disease Research Laboratory) - teste desenvolvido pelo Laboratório de Pesquisa de Doenças Venéreas é uma reação de microfloculação que emprega uma suspensão antigênica que contém cardiolipina, lecitina e colesterol (antígeno em suspensão em uma solução salina tamponada), forma grumos quando se combina com anticorpos presentes na amostra - pesquisa em LCR e soro - todos os soros reativos, fracamente reativos ou não-reativos atípicos na reação qualitativa devem, obrigatoriamente, ser analisados quantitativamente - indicação: é para triagem, acompanhamento e monitorização do tratamento e para critério de cura da sífilis

VDRL (Veneral Disease Research Laboratory) ‏ - RPR (Rapid Plasm Reagin) ‏ - suporte: cristais de colesterol - Ag: cardiolipina - placas escavadas - Uso: pesquisa de reaginas

Reação negativa Reação positiva

RPR (Rapid Plasma Reagin - Reagina Plasmática Rápida) ‏ - antígeno é preparado com uma suspensão de antígeno de VDRL modificada que contém cloreto de colina (elimina a necessidade aquecer soro); EDTA (para aumentar a estabilidade da suspensão); partículas muito finas de carvão (agente de visualização/melhora a visualização) ‏

Resultados: Reagente (floculação): as partículas de carvão se coaglutinam com os anticorpos e aparecem grumos negros / deve ser quantificada Não-Reagente: não há anticorpos presentes, a mistura fica com cor cinzenta uniforme reações falso-positivas e falso-negativas: Falso-positivo: erros, gravidez, no curso de doenças agudas tais como viroses diversas, tuberculose malária, etc., ou crônicas como artrite reumatóide, lúpus Falso-negativo: erros, fenômeno de pró-zona (excesso de reaginas) ‏

3. Testes Treponêmicos – confirmação dos resultados dos testes de cardiolipina (a) FTA-ABS (Fluorescent Treponemal Antibody Absorption) – para a pesquisa de anticorpos IgM e IgG - são testes mais específicos pois utilizam antígenos do T. pallidum, obtidos de testículos de coelho empregam como antígeno o Treponema pallidum vivo ou morto diagnóstico da sífilis congênita (FTA-IgM) e a avaliação do período de doença (FTA-IgG em infecções passadas) ‏ - diagnóstico confirmatório - alta especificidade e sensibilidade

Teste: soro do paciente (diluído em solvente - extrato de cultivo de treponema de Reiter - treponema não patogênico) lâmina com T. pallidum fixados previamente conjugado: imunoglobulina animal anti-humana marcada com isoticianato de fluoresceína - leitura ao microscópio de fluorescência

Fluorescência

Micro - hemaglutinação para Treponema pallidum - hemaglutinação indireta baseada na aglutinação de eritrócitos de carneiro, sensibilizados com antígeno Treponema pallidum - cepa Nichols - simples, não exige quipamento - reação-cruzada: soro diluído com diluente absorvente para eliminar possíveis anticorpos heterófilos de reação cruzada (anticorpos dirigidos contra as hemácias do carneiro) - reação positiva: “tapete” - reação negativa: botão compacto - sensibilidade e especificidade são comparáveis às do FTA-ABS

Hemaglutinação

ELISA IgM e IgG - antígenos treponêmicos são fixados em pocinhos e realiza-se a detecção de anticorpos específicos utilizam como suporte placas ou microesferas IgM: de preferência ELISA captura para IgM, ou remover a IgG detecção da IgM é muito importante na sífilis congênita por immunobloting Raio-X de Ossos Longos - demonstra alterações ósseas compatíveis com periostite, osteíte e osteocondrite

ELISA INDIRETO Ag fixado Ac da amostra lavagem conjugado lavagem substrato cromogênico leitura

Exame do líquido céfalo-raquidiano (LCR) ‏ - É necessário para detectar ou afastar a neurossífilis. - Alterações na contagem de linfócitos (>25 leucócitos/mm3); e na dosagem de proteínas (>100 mg/dl) do recém-nascido (após o período neonatal, os valores são >5 leucócitos e >40mg/D1, respectivamente) associados ou não com VDRL reagente, definem o quadro, e pode ocasionar lesões do sistema nervoso central – principalmente na sífilis tardia

Prevenção - uso regular de preservativos - redução do número de parceiros sexuais - diagnóstico precoce - tratamento imediato dos casos diagnosticados Tratamento - medicamentoso - cura, se tratado adequadamente - penicilina G/benzatina

AX, PARDINI Observações: - orientar os pacientes para que evitem relações sexuais até que o seu tratamento (e o do parceiro) se complete; uso de preservativo; realizar controle de cura trimestral através do teste não treponêmico quantitativo; tratar novamente em caso de quadruplicação dos títulos (ex.: de 1/2 para 1/8) ‏ - se não for tratada pode causar danos permanentes no cérebro, no coração e outros problemas de saúde a longo prazo no caso de gestantes pode causar sérios problemas ao recém-nascido incluindo a morte a presença de úlceras pode facilitar a transmissão de outros vírus como o VIH e hepatites

Testes de acordo com a fase % % % % 100% % 65-78% % SESE Micro Aglutinação % 100% % 100% % 100% SESE FTA-abs 60-75% % 74-90% % 100% % 70-80% % SESE VDRL RPR TerciáriaLatenteSecundáriaPrimáriaÍNDICETESTES