Identificação e caracterização de genes e enzimas para hidrolases glicolíticas no cupim Coptotermes gestroi visando a sua aplicação para a produção do bioetanol de segunda geração Aluno : João Paulo Lourenço Franco Cairo Orientador: Prof. Dr. Gonçalo A. G. Pereira Co-Orientador: Fábio Marcio Squina

Organização Introdução Objetivos Plano de trabalho Bioenergia e Bioetanol de 2º geração Hidrolases glicolíticas Biologia de cupim e de Coptotermes gestroi Hidrolases glicolíticas em cupim Objetivos Plano de trabalho Resultados preliminares Perspectivas

Introdução - Bioenergia e Bioetanol de 2º geração A problemática dos combustíveis fósseis Energias Alternativas Renovável Sustentável Biomassa O que é Biomasa? 60% Biomassa vegetal 90 % Compostos lignocelulósicos Parede celular Vegetal

Introdução - Bioenergia e Bioetanol de 2º geração A problemática dos combustíveis fósseis Energias Alternativas Renovável Sustentável Biomassa O que é Biomasa? 60% Biomassa vegetal 90 % Compostos lignocelulósicos Parede celular Vegetal

Bioetanol Introdução - Bioenergia e Bioetanol de 2º geração 1º Geração Caldo da cana 2 º Geração Material lignocelulósico Métodos de obtenção de 2º Geração Hidrólise Física e Química Hidrólise Enzimática

Introdução – Hidrolases Glicolíticas O que fazem? Classificadas em Famílias Cazy GH1 = B-Glicosidases GH 7 e 9 = Endo-Beta-Glicosidases GH12 = Endo-beta-Xilanases Tipos: Domínio Único Multidomínio

Introdução – Hidrolases Glicolíticas O que fazem? Classificadas em Famílias Cazy GH1 = B-Glicosidases GH 7 e 9 = Endo-Beta-Glicosidases GH12 = Endo-beta-Xilanases Tipos: Domínio Único Multidomínio

Biologia de cupim e de Coptotermes gestroi Insetos sociais Ordem Isoptera 7 Famílias Cupins superiores Cupins inferiores 2.700 espécies Origem no cretáceo Barata altamente especializada BIORREATOR NATURAL

Castas em Coptotermes gestroi

Biologia de cupim e de Coptotermes gestroi Espécie exótica Origem asiática Família Rhinotermitideae Xilófagos Cupim praga EST´s de C. gestroi (2006) 1200 reads 218 contigs 220 singlets 2 sequências para Celulases

Hidrolases glicolíticas em cupim Enzimas endógenas Endo-Beta-Glicosidase Beta-Glicosidase Coptotermes formosanus Neotermes koshunensis Enzimas simbiônticas (metagenômica) Xilanses Carboxi Estereases Pectinases Quase nenhum dado de Proteoma e carcterização bioquímica

Objetivos Identificar as hidrolases glicolíticas das frações do extrato cru protéico de Coptotermes gestroi por FPLC e purificá-las. Caracterizar bioquimicamente essas frações Identificação e sequenciamento protéico por MS/MS das frações do extrato cru e classificação com base no banco de dados de hidrolases glicolíticas (CAZY) Identificar possíveis alvos de clonagem para posterior expressão heteróloga e suas respectivas espécies produtoras. Clonagem das celulases endógenas identificadas na biblioteca de ESTs do cupim Coptotermes gestroi, e expressar heterologamente em modelo procarioto e caracterizar bioquimicamente.

Plano de trabalho (Expressão Heteróloga) Extração de RNA. Clonagem das celulases identificada a partir do banco de ESTs de Coptotermes gestroi Expressão heteróloga em modelo procariótico (Escherichia coli) Purificação e caracterização enzimática

Plano de trabalho (Metaproteômica) Extração protéica (Diversos pH) Purificação por FPLC (troca iônica), identificação das frações com atividade e filtração em gel das mesmas Liofilização das amostras e seqüenciamento e identificação por MS/MS Apresentação de alvos para posteriores clonagens Caracterização das frações purificadas ou parcialmente : pH ótimo, Temp ótima, teste de Inibição e co-fator.

Resultados anteriores e preliminares Clonagens dos genes de celulases endógenas Endo-Beta-Glicosidase (resultado Flávia) Beta-Glicosidase 3´UTR (resultado Flávia) 5´ UTR (RACE) endo-b-1,4-glucanase [Coptotermes gestroi] 1299 pb endo-b-1,4-glucanase [Coptotermes formosanus] Score = 645 bits (1665), Expect = 0.0 Identities = 349/389 (89%), Positives = 355/389 (91%), Gaps = 8/389 (2%) Frame = +1 N.koshunensis C.gestroi 300 pb 100 pb ~280à 300 pb

Resultados anteriores e preliminares Screening do estrato protéico de Coptotermes gestroi para diversos substratos pH 5.5 pH 10.0

Ensaio enzimático das divisões do cupim (corpo, cabeça e total) em tampão SAB 0,1 M e pH 5.5

Ensaio enzimático das divisões do cupim (corpo, cabeça e total) em tampão Glicina 0,1 M e pH 10,6

Resultados anteriores e preliminares Screening do estrato protéico de Coptotermes gestroi para diversos substratos pH 5.5 pH 10.0 Redução de atividades de Liquenana,CMC,Xilana em pH Básico e aumento da atividade contra Pectinas e Arabinanas FPLC de troca iônica Resource Q (Aniônica) Fosfato Potássio buffer pH 6.2 Atividade das frações (1,5 ml)

Frações de atividade para manana já foram enviadas para MS/MS Substrato/U Frações Xilana/ 1,9 18,19,20 Liquenana/ 5,5 11,12 CMC/0,9 3, 13 Manana/3,0 21,22 Frações de atividade para manana já foram enviadas para MS/MS

Perspectivas A geração de informação para o desenvolvimento de um coquetel de enzimas, co-fatores e nutrientes que mimetize o trato intestinal do cupim em escala laboratorial e industrial OBRIGADO!!!