Obtenção de enzimas e produtos de digestão enzimática Aula 5 De onde vêm as enzimas Conservação da enzima

Enzima Proteína; Função muito especifica; Alta especificidade pelo substrato; Atividade depende de fatores do meio; O tempo de atividade é relacionado a estabilidade da estrutura protéica; A relação de concentração de enzima e substrato deve ser equilibrada;

Processo fermentativo Várias reações enzimáticas ocorrendo em um meio liberando vários produtos por meio de um ser vivo, geralmente um microorganismo; Microorganismo com necessidades nutricionais, de meio e fatores externos ao meio; Água; nutrientes; pH ; temperatura; agitação; oxigenação e necessidades especiais

Escolha da enzima Qual o produto desejado? Qual a estabilidade do produto? Qual o meio que o produto estará ao final da reação? Qual a forma de recuperação do produto? Qual a forma de controle de qualidade e rendimento da reação é aplicável?

Qual o produto que eu quero? Produto de uma única reação enzimática; Produto de várias reações enzimáticas; Em qual etapa do processo há maior concentração do produto; Características físico químicas do produto Qualidade do substrato Processo de geração do produto Controle do processo de geração do produto Estabilidade do meu produto no meio

Estabilidade do meu produto no meio Produto da reação deve ser estável ao meio e as condições do meu meio; Produto deve sofrer o mínimo de interferência possível no meio a fim de aumentar o rendimento; Qual o local de maior concentração do produto no meio

Qual o meio que o produto estará ao final da reação? Sólido ; Líquido ; Vapor ; V-S; V-L; S-S; S-L; L-L Condições de pH, temperatura, pressão, pressão osmótica, etc... Aumentar a concentração do produto a fim de purificá-lo no meio

Qual a forma de recuperação do produto? As operações Unitárias aplicadas a recuperação do produto de reação enzimática podem ser: Processos de Escoamento de Fluidos: transporte de fluido; Filtração; fluidização sólida; Transferência de Calor processos: evaporação; Condensação; Transferência de Massa processos: absorção gasosa; Destilação; Extração; Adsorção; secagem ;

Qual a forma de controle de qualidade e rendimento da reação é aplicável? Características físico-químicas do produto; Método analítico adequado; Utilização do produto em uma reação controlada; Rendimento Obtenção do produto na concentração adequada; Presença de sub-produtos e contaminantes e baixas concentrações

E quando o produto é uma enzima Seleção da fonte de obtenção da enzima Método de obtenção; Método de purificação; Concentração; Conservação; Análise da atividade

Fonte de Enzimas Animais – órgãos ou células; Vegetais – partes ou células; Microorganismos – intra ou extracelular;

Fonte animais Suínos e bovinos: Amilase pancreática; Lipase pancreática; Pancreatina; Pepsina; Quimosina; Tripsina; Hialuronidase;

Fontes Vegetais Várias espécies: α-amilase; β-amilase; Bromelina; Ficina; Papaína; Etc...

Fonte microorganismo Sacaromices cerevisae; Lactobacillus sp. Bacillus subtilis; Aspergillus oryzae A.niger; A.flavus; A.awamori; Penicillium amagasakiense; P.notatum; Saccharomyces fragilis; Zygosaccharomyces lactis; Rhysopus sp.; Endothia parasítica; Mucor pusillus.

Produtos Produção de enzimas Produção de proteína unicelular Produção de inseticidas Produção de vacinas Produção de antibióticos Produção de etanol Produção de ácidos orgânicos: ácido acético (vinagre); ácido lático; ácido propiônico; ácido cítrico; ácido glucônico Produção de aminoácidos - lisina, ácido glutâmico Produção de enzimas Produção de solventes Produção de polissacarídeos Produção de lipídeos Produção de alimentos por fermentação lática : picles, azeitona, queijo, chucrute, iogurte

Principais produtos a partir do ácido pirúvico

Fonte microorganismo Alta variabilidade de espécies e cepas; Susceptibilidade a mutação e transgenicidade; Adaptável ao meio; Condicionamento a produção da enzima específica; Indução a produção da enzima específica; Enzima extracelular ou intracelular.

Algumas Enzimas Reproduzido de : http://www.livronline.com/servicos/gratuitos/ma002/capitulos/cap4.html

Obtenção de enzimas de microorganismos A espécie e cepa de interesse isolada; Crescimento em condições ideais; Formação de um inóculo; Adaptação ao meio de crescimento – fase lag; Crescimento em larga escala – fase log; Acúmulo/liberação da enzima – fase estacionária; Redução na produção – fase de declínio;

Obtenção de enzimas de microorganismos

Recuperação da enzima extracelular Enzima livre no meio; Grande probabilidade de encontrar o substrato; Alguns subprodutos podem inibir a enzima; Necessidade de parar a produção ou separar a enzima do meio; fazer coincidir o final da fermentação ao início da separação; à força iônica do fermentado deve ser a menor que a composição do meio; anti-espumante a fim de não influir na viscosidade do fermentado evitar a formação de eventuais pigmentos (inibidores).

Técnicas empregadas na concentração de enzimas extracelulares Precipitação; Adsorção; Ultrafiltração; Osmose reversa e Secagem

Exemplo : obtenção de Nuclease M.O.: Staphylococcus aureus CEPA UNIFAR1 Meio de enriquecimento : BHI High D- Glucose; Inóculo: 5x109 células por litro - em 1000ml; Meio de produção Mosto de Caldo de Cana com proteína animal; 15 horas de crescimento à 37°C com 10rpm;

Recuperação da enzima intracelular Enzima nop interior da célula – organelas e outras estruturas; Pequena probabilidade de encontrar o substrato; Inibi-se a enzima inibindoo crescimento do M.O.; Concentra-se o M.O. Maior dificuldade de separação da enzima de outras proteínas intracelulares; Maior manipulação da enzima;

Técnicas empregadas na concentração de enzimas intracelulares Cisalhamento sólido; Agitação com abrasivos; Cisalhamento líquido; Detergentes; Tratamento enzimático; Tratamento com álcali;

Cromatografias Afinidade Adsorção Troca iônica

Cromatografia de afinidade

Cromatografia de adsorção

Cromatografia de troca-iônica

Esquema de obtenção da pancreatina

Bibliografia LIMA, U.A., AQUARONE, E., BORZANI, W., SCHMIDELL, W. Biotecnologia Industrial. Vol.3,Editora Edgard Blucher, São Paulo, SP, 2001. BLANCH, H.W., CLARK, D.S. Biochemical Engineering. Marcel Dekker, Inc., New York USA,1996. GODFREY, T., WEST, S. Industrial enzymology. 2nd Ed., MacMillan Press LTDA, London UK,1996. GUTCHO, S.J. Microbial enzyme production, Noyes Data CO., Park Ridge, USA, 1974. JOHNSON, J.C. Industrial enzymes, Noyes Data CO, Park Ridge, USA, 1977. http://www.fcf.usp.br/Ensino/Graduacao/Disciplinas/Exclusivo/Inserir/Anexo s/LinkAnexos/Texto%20sobre%20no%C3%A7%C3%B5es%20de%20Fontes%20 e%20Produ%C3%A7%C3%A3o%20de%20Enzimas.pdf http://www.molecular-plant-biotechnology.info/enzyme- technology/production-of-enzymes.htm http://www.biosciregister.com/Enzyme_Production_and_Hydrolysis/Suppliers /pid258.htm