Mini-Revisão.

Apresentação em tema: "Mini-Revisão."— Transcrição da apresentação:

1 Mini-Revisão

2 Mini-Revisão

3 Começando a decifrar...

4 Ciclo Lítico do Fago l

5 Ciclo Lítico do Fago l

6 Ciclo Lítico do Fago l

7 O fenômeno de restrição-modificação
Infecções com bacteriófagos em diferentes cepas bacterianas produziam o fenômeno de restrição-modificação. Arber, 1962 Nathans & Smith, 1962

8 Enzimas de restrição

9 Clivagem de restrição

10 Clivagem de restrição

11 Sítio de Restrição

12 Nomenclatura das enzimas de restrição
EcoRI Escherichia coli BamHI Bacillus amyloliquefaciens RH BglII Bacillus globigii PvuII Proteus vulgaris HindIII Haemophilus influenzae Rd HinfI Haemophilus influenzae Rf Sau3A Staphylococcus aureus AluI Arthrobacter luteus TaqI Thermus aquaticus HaeIII Haemophilus aegyptius NotI Nocardia otitidis-caviarum

13 Fracionamento de DNA

14 Mapa de Restrição

15 Utilização do Mapa

16 Detectar mutações

17 Comparação de Mapas

18 Fracionamento de DNA

19 Como reconhecer o fragmento de interesse?

20 Complementariedade

21 Hibridação Calor ou pH = desnaturação

22 Reassociação Temperatura e força iônica

23 Sonda

24 Marcação da sonda Ou com Polinucleotídeo Quinase

25 Estringência Reação de Hibridação e Lavagem: especificidade da sonda
tamanho da sonda temperatura (T’m) força iônica Especificidade : identidade de seqüência Tamanho: fragmento/ oligonucleotídeo Temperatura: T’m - 25oC Força iônica: NaCl

26 Southern blot

27 Resultado

28 Hibridação in situ Localização de mRNA de ciclina (uma proteína que incita a célula a se dividir) = azul escuro Em azul claro os núcleos corados com DAPI

29 Hibridação in situ

30 Southern blot Animação

31 O que fazer com o fragmento?
Clonagem de DNA A clonagem permite a eternizar o fragmento Um pedaço de DNA de um eucarioto poderia ser produzido por um procarioto.

32 Vetores de clonagem O que deve ter uma molécula para ser um veículo de clonagem? 1. Replicação autônoma 2. Marcas de seleção 3. Sítio para clonagem

33 Sítio de clonagem O sítio de restrição deve estar nas duas moléculas a serem ligadas. Após a clivagem, as extremidades são recombinadas e a enzima LIGASE refaz a ligação fosfodiester.

34 Plasmídio recombinante

35 Transformação Hospedeiro: E.coli fenótipo e genótipo seleção,
contenção, multiplicação

36 Hospedeira transformada

37 Clonagem molecular

38 Outro vetor? Bacteriófagos e, mais recentemente, cosmídios são utilizados como vetores de clonagem, principalmente quando se deseja inserir um fragmento de DNA com tamanho de ~40 kb. YACs - fragmentos maiores ainda.

39 Biblioteca Genômica Genoteca

40 Varredura de biblioteca

41 Seqüenciamento de DNA Princípios

42 Reação em cadeia de polimerização
1. Replicação

43 PCR 2. Amplificação

44 PCR - ANIMAÇÃO Um momento, por favor, estou carregando o programa.