PCR e RT-PCR em Tempo Real

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1 PCR e RT-PCR em Tempo Real
Leila Barros

2 PCR Amplificação Exponencial

3 (DNA Polimerase) Polimerases procarióticas:
Polimerase I - Primeira enzima a ser caracterizada (Arthur Kornberg 1958) – (locus PolA) 103 KDa. Pol I- Síntese (5’-3’) e correção (3’- 5’’), exonucleásica (5’- 3’) Retira os fragmentos de Okazaki e completa o espaço. Clivada pela protease subtilisina resulta nos fragmentos: Maior (Klenow) de 68KDa com atividade 5’-3’ síntese e 3’-5’ correção Menor de 35KDa atividade exonucleásica 5’-3’ retira pequenas seqüências de 10pb ao mesmo tempo. Pol I pode iniciar a replicação em um nick do DNA (nick translation) Pol II- Envolvida no reparo do DNA preenchimento de espaços (“fill in”), não tem atividade exonucleásica (5’-3’). Pol III- síntese (5’-3’), correção (3’-5’) (replicação do DNA) Descoberta por Thomas Kornberg e Malcolm Gefter 1970

4 Klenow The Klenow fragment of DNA polymerase III has a shape somewhat like a right hand.

5 PCR-Histórico A PCR foi desenvolvida por Kary B. Mullis em 1983, Ganhou o premio Nobel de Química em 1993. Saiki, R. K., D. H. Gelfand, S. Stoffel, S. J. Scharf, R. Higuchi, G. T. Horn, K. B. Mullis, and H. A. Erlich. Primer-Directed Enzymatic Amplification of DNA with a Thermostable DNA Polymerase. Science 239 (1988): Polimerase de organismos termofílicos Taq DNA polymerase Thermus aquaticus DNA polymerase (Yellowstone National Park ) temperatura ótima de ( °C) não tem atividade 3'→5' exonucleásica, gera mutações Polimerases Pwo or Pfu, de Archaea, tem atividade exonucleásica 3'→5' reduzindo o número de erros do DNA copiado, mas é muito lenta Combinações de Taq e Pfu resulta em enzimas com alta atividade e alta fidelidade. Polimerase Platinum tem atividade de correção (3’- 5’) é acoplada a um anticorpo, sendo ativada após aquecimento a 94C (hot start PCR). Menos sensível a variações de MgCl2

6 Ex. de polimerase

7 PCR- Protocolo DNA, primers, dNTPs, tampão, Mg2+ e a polimerase
programa thermociclador tempos e temperaturas desnaturação anelamento extensão 20-40 cycles Análise do resultado da reação (amplicons) STEP TEMP TIME NOTES Desnaturação 94-96 °C 0.5-2 min Taq incorpora 150 nucleotídeos/seg Anelamento 5-15 °C <Tm 0.5-2 min Extensão 72-75 °C ~1 min (<kb)

8 RT-PCR PCR com Transcriptase Reversa

9 PCR- preparo da reação

10 Real Time PCR ou RT-PCR descrição
Utilizada para quantificar o número de cópias de um gene (templete/ molde) Utilizada para quantificar a expressão de genes; É uma técnica que combina amplificação e detecção em um único passo; Usa diferentes componentes fluorescentes correlacionando o produto da PCR com a intensidade de fluorescência; Quanto maior a quantidade de DNA alvo inicial mais rápido aumentará a fluorescência; É 1000 vezes mais sensível que hibridização (blot); Capaz de detectar uma única cópia de um transcrito específico; Requer muito menos RNA do que outros métodos de quantificação. Equipamento e reagentes caros; É necessário um profundo conhecimento do equipamento e das técnicas de normalização.

11 Fluoróforos – moléculas que absorvem e emitem luz (l específico).
Sybr®Green TaqMan®, Molecular beacons Molecular beacons Adaptado de Caroline, M.N. et al., 2004 Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento, Ed. 33: 10-13

12 TaqMan Probes Primer/Sonda (probe) 50-150 bp (amplicon)
Sonda contém fluoróforo e quencher Atividade exonucleásica da Taq libera o fluoróforo emitindo fluorescencia Aumento da emissão de luz de forma exponencial O método TaqMan é mais acurado do que o SYBR green, mas é mais caro Primer/Sonda (probe) bp (amplicon) 20-26 bases (probe) Tm da sonda 8-10o > temperature anelamento

13 Molecular Beacons Primer/Probe Design 50-150 bp (amplicon)
‘’hairpin’’ nas extremidades + quencher e fluoróforo Somente fluoresce durante o anelamento Primer/Probe Design bp (amplicon) ~21 bases homologous to target 6 bases stem (5 G:C) Tm of probe : 8-10o > annealing temperature

14 Molecular Beacons

15 dsDNA binding dye (eg., SYBR green)

16 Normalização Normalização de dados é usado para corrigir variações entre amostras -Em condições ideais a concentração do DNA ou RNA poderia ser padronizado pelo número de células mas -Os resultados são normalizados com genes de expressão constitutiva (housekeeping genes) – genes com expressão estável RNA total, actina, gliceraldeído 3 fosfato desidrogenase, rRNA (28S), etc É recomendado usar vários genes constitutivos para normalização A Maior fonte de variação na reação de PCR em tempo real é devido a performance da pessoa que manipula.

17 PCR Curva de Amplificação Quatro Grandes Fases

18 PCR em Tempo Real Curva de Amplificação
Ct = cycle threshold = momento (PCR- ciclo) no qual o fluorescência é maior que o background. Adaptado de Caroline, M.N. et al., 2004 Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento, Ed. 33: 10-13

19 Ajuste da linha de base e threshold (início da amplificação)
• Fase de Platô (a) • Fase Linear phase (b) • Fase Exponencial (geometric phase) (c) • Background (d) Curva de amplificação típica

20 Curva de Dissociação Temperature (°C)
O produto específico apresenta uma temperatura de desnaturação de (Tm ) de 80.5 °C O dímero de primer apresenta Tm de 75 °C.

21 Quantificação do número de cópias do gene em estudo
Absoluta: baseia-se na comparação com um padrão cujo número de moléculas é conhecido. Prepara-se uma curva padrão onde o número de cópias do gene de interesse ou “amplicon” é conhecido Relativa: Baseia-se na comparação com um gene endógeno conhecido (gene de referência).

22 Quantificação absoluta
Preparar uma curva padrão na qual o gene de interesse apresenta-se: cópias; cópias; cópias;300 cópias: 30 cópias Exemplo: RNaseP de humanos o qual existe uma cópia por genoma haplóide ou duas cópias por célula humana. 1- Identificar o tamanho do genoma Genoma humano 3 bilhões de pb (hapóide) 2- Identificar a massa do DNA por genoma m= número de pb x massa de cada nucleotídeo Massa do genoma humano haplóide 3x109 x 1,096x10-21g = 3,3 pg Genoma haplóide do algodoeiro= 3,23 pg

23 Quantificação absoluta
3- Dividir a massa do genoma pelo número de cópias do gene estudado no caso do gene RNaseP (1 cópia/genoma haplóide) 3,3pg / 1= 3.3pg tem-se uma cópia Hipoteticamente se fossem 2 genes 3.3 pg /2= 1,75 pg para 1 cópia 4- Calcular a massa do gDNA necessária para alcançar os números de cópias de a 30 Número de cópia massa genoma haplóide massa do gDNA necessária (pg) X 3,3 pg 30.000 99.000 3.000 9.900 300 990 30 99

24 Quantificação absoluta
5- Calcular a concentração do DNA necessária para que em 5 L se tenha a massa do gDNA desejada. Número de cópias Massa do gDNA necessária (pg) ÷5 L Conc. Final (pg/L) de gDNA 30.000 99.000 19.800 3.000 9.900 1.980 300 990 198 30 99 19,8

25 Quantificação absoluta
6- preparar diluições seriais do gDNA Quantificar o gDNA no espectrofotômetro Ex. de leitura = 1,2g/L - Preparar as diluições utilizando a fórmula C1.V1 = C2 .V2 Onde C1= conc inicial do gDNA V1 = volume que se precisa C2= conc. Final ex pg/  L V2= Volume final ex. 100 L pg/  L x V1 = pg/ L x 100 L V1 = 16,5  L Preparo final da diluição 16,5  L do gDNA uL de água Prepara-se as diluições seguintes utilizando a fórmula: C1.V1 = C2 .V2

26 Softwares para análises

27 Bibliografia Real-time PCR for mRNA quantification
Marisa L. Wong and Juan F. Medrano. BioTechniques, 39: (July 2005) mRNA Quantification by Real Time PCR TaqMan Polymarase Chain Reaction: Validation and Comparative with RNase Protection Wang T, Brown MJ. Analytical Biochemistry 1269: (1999). Quantification of mRNA Using Real-Time Reverse Transcription PCR (RT-PCR): Trends and Problems. Journal Molecular Endocrynology, 29: Creating Standard Curves with Genomic DNA or Plasmid DNA Templates for Use in Quantitative PCR