10º Simpósio de Vitivinicultura do Alentejo CONTROLO DE QUALIDADE DE VINHOS: Validação de um método rápido e simples para a quantificação de fenóis voláteis.

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2 10º Simpósio de Vitivinicultura do Alentejo CONTROLO DE QUALIDADE DE VINHOS: Validação de um método rápido e simples para a quantificação de fenóis voláteis relacionados com o “Brett character” Juliana Milheiro 1,2, Luís Filipe-Ribeiro 1,2, Fernanda Cosme 2, Fernando Nunes 1 1 Centro de Química - Vila Real (CQ-VR), Departamento de Química, Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro, Escola de Ciências da Vida e do Ambiente, Vila Real, Portugal. 2 Centro de Química - Vila Real (CQ-VR), Departamento de Biologia e Ambiente, Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro, Escola de Ciências da Vida e do Ambiente, Edifício de Enologia, Vila Real, Portugal. 4, 5 e 6 de Maio, Évora

3 Brettanomyces spp. Considerada uma levedura de contaminação Encontrada na superfície das uvas ou nas barricas de carvalho utilizadas para a fermentação/ envelhecimento do vinho Atividade relativamente baixa, podendo só ser notada no produto final Responsável pela formação de fenóis voláteis no vinho tinto Centro de Química - Vila Real3

4 Fenóis Voláteis 4-etilfenol (4-EF) e 4-etilguaiacol (4-EG) Defeito sensorial chamado “Brett character” Aroma associado a “suor de cavalo”, “estábulo”, “animal”, “rato” ou “couro” Centro de Química - Vila Real4

5 Como se formam? Centro de Química - Vila Real5

6 O Impacto na Enologia Estratégias de prevenção: Higienização correta e eficaz da adega Níveis de sulfuroso adequados A contaminação continua a constituir um problema Centro de Química - Vila Real6 É URGENTE Reduzir os níveis dos fenóis voláteis sem afetar a qualidade do vinho

7 Centro de Química - Vila Real7 Objetivo Reduzir os níveis dos fenóis voláteis no vinho Método Validar um método simples e rápido para a quantificação da concentração total; SPME para quantificar a concentração no espaço de cabeça Estratégias de redução Testar a aplicação de um conjunto de produtos enológicos no vinho Aplicação do método Verificar quais os produtos que reduzem as concentrações dos fenóis voláteis Conclusão Avaliar a influência dos produtos na qualidade do vinho

8 Método de extração Otimização e validação de um método rápido e simples baseado na técnica de extração líquido-líquido (LLE) e quantificação por cromatografia gasosa/ espectrometria de massa (GC-MS) para avaliar a concentração total dos fenóis Centro de Química - Vila Real8 20 mL de vinho + 2 mL de 3,4- dimetilfenol + 2 mL de pentano/ éter dietílico (2:1) + 0,5 g de NaCl Agitar 400 rpm Centrifugar 4°C 12000 rpm Retirar sobrenadante para análise por GC-MS/SIM

9 Análise por GC-MS Coluna ZB-5 Inferno (30 m x 0,25 mm, 0,25 μm de espessura) Injeções de 5 μL em splitless durante 2 minutos Fluxo de 1 mL/min de hélio Programa de temperaturas: –5 minutos a 40ºC –Sobe até 155ºC a 5ºC/min –Sobe até 300ºC a 20ºC/min –1 minuto a 300ºC Centro de Química - Vila Real9

10 Análise por GC-MS Monitorização seletiva de iões (SIM): –m/z 107 para o 4-etilfenol –m/z 122 para o 3,4-dimetilfenol –m/z 137 para o 4-etilguaiacol Quantificação: –Método do padrão interno Centro de Química - Vila Real10

11 Validação do método Limites de deteção e de quantificação abaixo do limiar de perceção do 4-etilfenol (605 μg/L) e do 4-etilguaiacol (110 μg/L) em vinho Boas características analíticas, com uma gama de concentrações adequadas às quantidades destes fenóis encontradas no vinho Centro de Química - Vila Real11 Gama de linearidade (μg/L) Limite de deteção (μg/L) Limite de quantificação (μg/L) Repetibilidade (%DPR) Precisão intermédia (%DPR) 4-EF 10-1000 7,9424,1 19,1 4,72 18,0 3,85 4-EG3,5810,8 18,3 7,46 22,0 11,2

12 Cromatograma da LLE Centro de Química - Vila Real12 Bom sinal para ambos os compostos numa baixa concentração (10 μg/L).

13 Metodologia SPME Avaliação da concentração dos fenóis no espaço de cabeça do vinho Fibra DVB/CAR/PDMS 10 mL de vinho num vial vedado com um septo de teflon Extração por exposição da fibra durante 30 minutos a 25°C sob agitação Injeção no GC-MS/SIM Centro de Química - Vila Real13

14 Ensaio de colagem Nove produtos enológicos de origens diferentes Vinho tinto da Região Demarcada do Douro fortificado com 300 μg/L de 4-EG e 1500 μg/L de 4-EF À escala laboratorial: 200 mL de vinho em provetas seladas durante seis dias Centro de Química - Vila Real14

15 Características do vinho tinto pH 3,70 Teor alcoólico 13,8 % (v/v) Massa volúmica (20ºC) 0,9958 g/mL Acidez titulável 5,4 g/L de ácido tartárico Acidez volátil 0,38 g/L de ácido acético Centro de Química - Vila Real15

16 Centro de Química - Vila Real16 Cola de peixe Albumina de ovo Gelatina Caseinato de potássio Carboximetilcelulose Quitosana Bentonite PVPP Carvão ativado Polissacarídeos Minerais Sintéticos 16 Proteínas

17 Análise dos parâmetros do vinho Antocianinas monoméricas e ácidos fenólicos analisados por HPLC Intensidade corante determinada pela soma das absorvâncias a 420, 520 e 620 nm Tonalidade corante quantificada pelo rácio da absorvância a 420 e 520 nm Antocianinas coradas, pigmentos poliméricos e compostos fenólicos totais (flavonóides e não- flavonóides) foram determinados segundo procedimentos descritos na literatura Centro de Química - Vila Real17

18 Redução da concentração total de 4-EF e 4-EG Centro de Química - Vila Real18

19 Redução da concentração de 4-EF e 4-EG no espaço de cabeça Centro de Química - Vila Real19

20 Efeito das colas no vinho Centro de Química - Vila Real20 Carvão ativado Antocianinas totais Não-flavonóides Pigmentos totais Ácidos etil cafeico e etil cumárico Albumina de ovo Ácido gálico

21 Efeito das colas no vinho Centro de Química - Vila Real21 Cola de peixe Pigmentos poliméricos Antocianinas coradas CMC Intensidade de corante Antocianinas totais Pigmentos totais Bentonite Fenóis totais Não-flavonóides Ácido etil cafeico

22 Conclusões O método otimizado e validado foi aplicado com sucesso em vinhos tintos contaminados O carvão ativado foi o que removeu os fenóis voláteis mais eficientemente, afetando mais as características do vinho A albumina de ovo poderá ser uma alternativa para vinhos com baixa contaminação de fenóis voláteis Os produtos que reduziram apenas os fenóis voláteis no espaço de cabeça deverão ser melhor estudados, uma vez que poderão ser uma alternativa Centro de Química - Vila Real22

23 Centro de Química - Vila Real23 Orientadores: Professor Doutor Fernando Nunes Professora Doutora Fernanda Cosme juliana.milheiro@hotmail.com

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