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A técnica de preparo do inóculo inicial ou starter compreende duas fases:  laboratório;  industrial. A cada passo, os microrganismos devem crescer.

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4 A técnica de preparo do inóculo inicial ou starter compreende duas fases:  laboratório;  industrial. A cada passo, os microrganismos devem crescer rapidamente, sendo as transferências feitas na fase log de crescimento.

5 O número de transferências vai depender do volume útil do pré- fermentador (germinador). Dependendo do volume do fermentador de produção, poderá ser necessário mais de um germinador. Se o inóculo inicial estiver fora de escala - pequeno:  demora excessiva no início da fermentação – fase lag;  riscos de contaminação;  inativação por osmo-repressão do mosto.

6 Classificação Em escala industrial, muitos processos são adaptados com o objetivo de otimizar a produção. Os processos descontínuos são classificados de acordo com o modo como a inoculação é realizada em três grandes grupos: 1)Culturas puras - inoculação de uma dorna com um microrganismo que foi propagado a partir de uma cultura pura;

7 2) Recirculação do microrganismo - reaproveitam como inóculo o microrganismo da batelada anterior. a)Sedimentação do microrganismo – destilarias de álcool; b)Separação das células por centrifugação. 3)Por meio de cortes - opera-se da seguinte maneira: inocula-se uma cuba (chamada de A), quando a fermentação atinge um determinado estágio, passa-se parte do conteúdo para uma dorna vazia (chamada B) e, em seguida, enchem-se as duas com meio de cultivo. Essa operação é chamada de cortes. Diz-se que a dorna A foi cortada para a dorna B.

8 Fluxograma do processo de fabricação de levedura para panificação

9 Crescimento Populacional: É definido como o aumento do número, ou da massa microbiana.  Taxa de crescimento: é a variação no número ou massa por unidade de tempo.  Tempo de geração: é o intervalo de tempo necessário para que uma célula se duplique. O tempo de geração é variável para os diferentes organismos, podendo ser de 10 a 20 minutos até dias, sendo que em muitos dos organismos conhecidos, este varia de 1 a 3 horas. O tempo de geração pode ser calculado quando uma cultura encontra- se em fase exponencial, pela fórmula abaixo: N=No.2 n N  número final de células No  número inicial de células n  número de gerações. n= log(N) - log(No)/0.301 g = t/n g  tempo de geração t  tempo de crescimento n  determinado acima

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11 Medidas do Crescimento Microbiano O crescimento dos microrganismos pode ser mensurado por diferentes técnicas, tais como pelo acompanhamento da variação no número ou peso de células. 1) Contagem total de células: Esta metodologia envolve a contagem direta das células em um microscópio, utilizando-se câmaras de contagem. A contagem direta é uma técnica rápida, mas tem como principais limitações a impossibilidade de distinção entre células vivas e mortas (o que pode ser contornado pelo uso de corantes vitais, para leveduras) e contagens errôneas, devido às pequenas dimensões de algumas células, ou pela formação de agregados celulares.

12 2) Contagem de células viáveis: Procedimento também conhecido como contagem em placa, que estima o número de células viáveis – vivas - em uma amostra. Esta metodologia envolve a coleta de alíquotas de uma cultura microbiana em diferentes tempos de crescimento, as quais são então inoculadas em meio sólido. Após a incubação dos meios, o número de colônias é contado. Como uma colônia normalmente é originada a partir de um organismo, o total de colônias que se desenvolvem no meio corresponde ao número de células viáveis presentes na alíquota analisada.

13 3) Massa de células: Pode ser determinada a partir da estimativa do peso seco ou do peso úmido de uma cultura. Este tipo de procedimento é realizado quando não é necessário determinar o número preciso de microrganismos presentes. Peso seco: Muito utilizado na quantificação de fungos, onde o micélio é retirado da cultura, lavado e transferido para um frasco e submetido à secagem. Realizam-se então sucessivas pesagens, até o momento onde não observa-se mais variações. Este procedimento pode também ser realizado centrifugando-se a cultura e pesando o sedimento, ou então secando-o e depois pesando.

14 4) Turbidimetria: Quantificação em espectrofotômetro ou colorímetro a 660 nm, uma vez que neste comprimento de onda, a cor geralmente parda dos meios de cultura não interfere com os resultados. Tal metodologia requer a confecção de uma curva padrão. Embora a análise turbidimétrica seja menos sensível, é de rápida e fácil execução. Entretanto, não permite a determinação de células viáveis.

15 5) Análises químicas: A partir da quantificação de proteínas ou de nitrogênio, ou por meio da análise de diferentes atividades metabólicas. Gráfico da quantidade de oxigênio dissolvido versus tempo na fermentação de Pichia pastoris X-33. Laboratório 4. A quantidade de O 2 dissolvido reflete a atividade metabólica do microrganismo durante a fermentação.


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