Meselson & Stahl, 1958 DNA polimerase: Síntese de DNA necessita de cadeia molde Síntese de DNA na direcção 5’  3’ DNA polimerase necessita de sequência.

Apresentação em tema: "Meselson & Stahl, 1958 DNA polimerase: Síntese de DNA necessita de cadeia molde Síntese de DNA na direcção 5’  3’ DNA polimerase necessita de sequência."— Transcrição da apresentação:

1

2 Meselson & Stahl, 1958

3

4 DNA polimerase: Síntese de DNA necessita de cadeia molde Síntese de DNA na direcção 5’  3’ DNA polimerase necessita de sequência iniciadora (“primer”), com grupo 3’-OH livre

5 Síntese de DNA na direcção 5’  3’ (cadeia líder) (cadeia seguidora) (garfo de replicação) Reiji Okasaki et al., 1960

6 A A G T C 5’  3’ Ligação fosfodiéster Terminal 5’ Terminal 3’

7 dTTP

8 DNA polimerase: Síntese de DNA necessita de cadeia molde Síntese de DNA na direcção 5’  3’ DNA polimerase necessita de sequência iniciadora (“primer”), com grupo 3’-OH livre

9 3’ 5’ PRIMASE 3’ 5’ 3’ 5’ RNA (primer) DNA POLIMERASE 3’ 5’ 3’ DNA

10

11 FIDELIDADE DA REPLICAÇÃO Frequência de erros na introdução de nucleótidos pela DNA polimerase: 10 -6 Frequência de erros na replicação: 10 -9 (actividade de exonuclease 3’→5’ da DNA polimerase)

12 Polymerase Chain Reaction (PCR) Reacção em cadeia catalizada pela polimerase + DNA polimerase dATP + dCTP dGTP dTTP (Nucleótidos) + (Primers em excesso) 1º Ciclo

13 2º Ciclo

14 3º Ciclo

15 Desnaturação: 95ºC Emparelhamento dos primers: 50-60ºC Extensão das cadeias pela DNA polimerase: 72ºC para a Taq polimerase

16 Características dos primers a usar no PCR? ~20 nucleótidos de DNA em cadeia simples Emparelhamento com o terminal 3’ de cada uma das cadeias a amplificar Específicos para o fragmento a amplificar Temperatura de emparelhamento semelhante para os dois primers do par Não devem formar dímeros consigo próprios ou entre si

17 Cálculo da temperatura de fusão (T m ) de um primer: T m =(4  [G+C]) + (2  [A+T]) Usar na reacção de PCR temperatura de emparelhamento dos primers 4ºC inferior à T m