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André F. de Camargo Guilherme M. G. Filho Leonardo Lima.

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1 André F. de Camargo Guilherme M. G. Filho Leonardo Lima

2 Os avanços na genética molecular têm aberto novas perspectivas para elucidar a relação entre os genes e seus fenótipos. Essas tecnologias podem ser utilizadas para o estudo dos mecanismos moleculares envolvidos em processos biológicos importantes.

3 A expressão deve ser medida sob condições experimentais e ambientais

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5 (Laboratório ou natureza)

6 Estudo funcional X Análise global

7 Os genes são expressos através da transcrição do DNA em um mRNA simples fita; O mRNA é posteriormente traduzido em uma proteína; A expressão do mRNA representa o aspecto dinâmico de uma célula.

8 AnoAcontecimento 1965 Sequenciamento da primeira molécula de RNA; 1977 Desenvolvimento da técnica Northern blotting e o Método de Sequenciamento de Sanger; 1989 Relatos de experiências de RT-PCR para análise do transcriptoma; 1991 Primeiro estudo de sequenciamento EST de alto rendimento; 1992 Introdução da Exibição Diferencial, para a descoberta de genes expressos deferentemente; 1995 Relatos de MICROARRAY e dos Métodos de análise serial da expressão gênica (SAGE); 2001 Projeto do genoma humano concluído; 2005 Tecnologia de sequenciamento de primeira geração introduzido no mercado; 2006 Os primeiros estudos de sequenciamento de Transcriptona usando uma tecnologia de próxima geração (454/ROCHE).

9 Dentro deste contexto podemos citar as seguintes técnicas: Northern Blotting; RT (reverse transcriptase) PCR; Microarranjo e Macroarranjo de DNA; Differential Display of RNA; Análise de ESTs; Real Time PCR; SAGE; RNAseq;

10 Northern blotting é uma técnica para detecção de sequências de RNA específicas. Desenvolvido por James Alwine e George Stark na Universidade de Stanford em 1979.

11 O RNA é isolado a partir de várias amostras biológicas (por exemplo, vários tecidos, diferentes fases de desenvolvimento do mesmo tecido, etc)? * RNA é mais susceptível à degradação do que o DNA.

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16 membrana é lavada para remover a sonda não ligada

17 Agora, os padrões da sequência de interesse nas diferentes amostras de expressão podem ser comparados. A sonda marcada é detectada através de autorradiografia ou através de uma reação de quimioluminescência (se quimicamente uma sonda marcada é utilizada) Em ambos os casos, isto resulta na formação de uma banda escura sobre uma película de raios-X.

18 Um padrão para o estudo da expressão de genes ao nível de RANm (transcrição de RNA mensageiro) Estudar a degradação do RNA Estudar o splicing do RNA Estudar a meia vida do RNA

19 O método de Northern Blot padrão é relativamente menos sensível do que outros ensaios Detecção com sondas múltiplas é um problema Se as amostras de RNA são ligeiramente degradada por ARNases, a qualidade dos dados e quantificação de expressão será afetada negativamente.

20 RT-PCR é uma de muitas variantes de reação em cadeia da polimerase (PCR); É o método mais sensível para a detecção e quantificação de mRNA disponível no momento, podendo ser utilizada para quantificar os níveis de mRNA a partir de amostras muito pequenas. O objetivo dessa técnica é analisar se o gene está ou não sendo expresso. RT-PCR mRNAcDNAPCRVetor Biblioteca Trasncriptase Reversa Sequenciamento

21 biologia12c.wordpress.com/2010/01/14/dna- complementar-cdna/

22 Benefícios: Maior reprodutibilidade Sensibilidade Análise quantitativa Acompanhamento da reação de forma mais rápida e precisa

23 Quantificar o número de cópias de um gene (templete/molde) Amplificação e detecção em um único passo + componentes fluorescentes: o produto da PCR + a intensidade de fluorescência Maior a quantidade de DNA alvo inicial = mais rápido mento da fluorescência; Requer muito menos RNA

24 TaqMan®, Sybr®Green Baixo custo Sensibilidade Facilidade de trabalho Inespecificidade Alta especificidade Caro

25 Fase Geométrica Fase Linear

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27 Equipamento e reagentes caros; É necessário um profundo conhecimento do equipamento e das técnicas de normalização.

28 Essa técnica determina, simultaneamente, os níveis de expressão de milhares de genes (SCHENA et al., 1995) São utilizados em experimentos de análise de expressão gênica em larga escala Necessidade de se analisar a grande quantidade de informação gerada pelo sequenciamento genomico Microarranjos de DNA (Chips de DNA)

29 Arranjo pré-definido de moléculas de DNA (fragmentos de DNA genômico, cDNAs ou oligonucleotídeos) quimicamente ligadas à uma superfície sólida

30 Células cujo DNA possui os genes de interesse são cultivadas em duas soluções distintas: uma correspondendo à situação biológica normal (padrão), outra correspondendo à situação a ser estudada;

31 Recolhe-se o mRNA das duas soluções, marcando os mRNA de cada solução com uma substância fluorescente. Normalmente são utilizados corantes cy3 (verde) e cy5 (vermelho);

32 3. Os mRNA marcados são misturados e aplicados nos microarranjos de DNA; 4. Ocorre a hibridização dos microarranjos com a mistura de mRNA. A base de um experimento envolvendo microarranjos de DNA é o processo de hibridização. Somente os genes que possuírem seqüências complementares aos mRNA marcados deverão apresentar algum nível de expressão.

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35 Recentemente desenvolvida perfil de transcriptoma, utilizando tecnologias de deep-sequencing. TRANSCRIPTOMA: o conjunto completo de transcritos (RNAs) em uma célula, e sua quantidade, para um estágio de desenvolvimento específico ou condição fisiológica.

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