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Expressão gênica através de ensaios com PCR Quantitativo em Tempo Real Fernando Colbari do Amaral.

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Apresentação em tema: "Expressão gênica através de ensaios com PCR Quantitativo em Tempo Real Fernando Colbari do Amaral."— Transcrição da apresentação:

1 Expressão gênica através de ensaios com PCR Quantitativo em Tempo Real Fernando Colbari do Amaral

2 Expressão

3 Expressão gênica

4 Estudos de Expressão Gênica Comparação de diferentes sistemas gênicos Célula normal vs tumor Comparação da expressão gênica em diferentes tecidos Função gênica específica (cultura de células) Comparação da expressão gênica em diferentes populações (cultura de células) Controle vs tratado

5 Isolamento

6 Extração de RNA total mRNA´s Genes diferentes

7 Quantificação da expressão gênica

8

9 Reação em Cadeia da Polimerase RT-PCR semi-quantitativa PCR em Tempo Real Métodos de quantificação da expressão gênica

10 Primers/Sondas 3´ 5´ DNA dupla fita 5´ 3´ dNTP Taq DNA Polimerase PCR

11 Síntese de cDNA

12 5´ 3´ 5´ 3´ 5´ 3´ 5´ Desnaturação Anelamento Extensão PCR – 1° ciclo

13 Amplificação

14

15 Diluição seriada do cDNA 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128 etc... RT-PCR semi-quantitativa

16 cDNA em concentrações decrescentes 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128 Amplificação na maior diluição corresponde a uma maior quantidade de cópias do gene na amostra 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128

17 PCR-quantitativo inicial Sistema Fluorescente Método usado para medir a quantidade inicial de ácidos nucléicos (DNA-RNA) que será amplificada por PCR – Sistema Fluorescente Validação da expressão gênica global Microarray SAGE

18 PCR-quantitativo - Eficiência Preparo da reação (pipetas calibradas) Qualidade do template (molde) Desenho dos primers (dimers) Condições de termociclagem Concentração dos reagentes (MgCl 2 ) Tamanho do amplicon ( bp)

19 Características Fonte de excitação: Lâmpada de Tungstênio Sistema aberto que permite uso de outros fluoróforos, desde que tenham compatível com os filtros disponíveis Metodologia de aquecimento e resfriamento de bloco (desnaturação, anelamento e extensão) Filtros

20 Sistema de detecção

21 SYBR ® Green Intercalante de DNA dupla fita Fluoróforo em suspensão Inespecífico Curva de dissociação ou melting Não permite multiplex

22 Curva de dissociação Obrigatória a realização quando utilizar o SYBR ® Green – Inespecífico Permite verificar se há um ou mais produtos de PCR presentes em cada reação Realizada ao término da termociclagem

23 Sistema TaqMan ® Baseia-se na atividade 5- 3 exonuclease Trabalha com sondas que contém fluoróforos Específico Permite Multiplex Não necessita curva de dissociação Sonda: Quencher e Reporter na mesma molécula: transferência de energia

24 RQ 53 RQ 53 R Q

25 Q Q R R

26 Características da sonda Localiza-se de 1 a 5 pb do primer Tm deve ser ~10°C maior Tm dos primers A primeira base não pode ser G (Quencher) Não pode ter mais G do que C e não deve ter 4 bases consecutivas iguais Pode ter Quencher fluorescente (TAMRA) ou não fluorescente (Minor Groove Binder)

27 Condições de Amplificação Condições Universais para desenho dos oligos: - Amplicon de 50 a 100 pb - Conteúdo de GC - Primers com Tm= 60°C e Sonda com Tm= 70°C Condições Universais de Termociclagem: Anelamento e Extensão Desnaturação Ativação da AmpliTaq Gold Uracil-N-Glicosilase

28

29 Terminologia Fase onde a intensidade de sinal de produto amplificado ainda não ultrapassa a intensidade da fluorescência encontrada no meio. Baseline

30 Terminologia Threshold Nível de fluorescência onde a reação é detectada durante a fase exponencial; linha de comparação entre as amostras

31 Terminologia Cycle Threshold (C T ) Ciclo (ponto no tempo) onde a reação cruza o limiar de detecção (Threshold)

32 Terminologia RnRn Sinal do Reporter dividido pelo sinal de referência passiva (sinal do ROX). Normalização empregada para corrigir erros de pipetagem

33 Tipos de Quantificação Expressão variável em diferentes tecidos ou diferentes fases do desenvolvimento Músculo PeleNeurônio

34 Tipos de quantificação Quantificação Absoluta Determinação do número exato de moléculas. Obtêm-se valores numéricos com alguma unidade, como número de cópias ou nanogramas de DNA. Quantificação Relativa Análise comparativa do ácido nucléico alvo com o do controle interno ou do calibrador São comparados os Cts de cada amostra e os resultados representam ordens de grandeza (p.e: 5x mais ou menos expressão de um determinado gene).

35 Controle endógeno Expressão constitutiva (GAPDH, β-actina, 18S) Corrigir variações de eficiência da transcrição reversa Corrigir a presença de inibidores Corrigir diferenças na quantificação de RNA Corrigir degradação de material (RNA) Normalização dos resultados

36 Controle Endógeno ideal Um bom normalizador é aquele cuja expressão gênica não tenha variação entre os tecidos submetidos a análise Expressão em A = Expressão em B Expressão no Tratado Expressão no Controle = ~1

37 Quantificação absoluta Necessita de uma curva padrão

38 Quantificação absoluta Cálculos com curva Standard C-mycGAPDHC-myc N Tissueng Total RNA Normalização GAPDH Relação cérebro Cérebro0.039 ± ± ± ± 0.12 Rim0.41 ± ± ± ± 0.35 Fígado0.70 ± ± ± ± 2.37 Pulmão0.93 ± ± ± ± 1.09 C-myc GAPDH C-myc N _______________________________________________ C-myc Calibrador

39 Quantificação relativa Cálculos sem curva Standard C-mycGAPDH Ct 2^- Ct TissueAverage Ct C-myc- GAPDH Ct- Ct Brain Rel. to Brain Cérebro30.49 ± ± ± ± ± 0.11 Rim27.03 ± ± ± ± ± 0.32 Fígado26.25 ± ± ± ± ± 2.52 Pulmão25.83 ± ± ± ± ± 1.10 C t = C t (alvo)- Ct (controle endógeno) C t = C t (sample)- Ct (calibrador) Quantidade Relativa = 2 - Ct

40 Ensaios customizados Primers e sondas no mesmo tubo. Elimina o passo de balancear as concentrações. Foco em resultados: elimina tarefas manuais de desenho de primers/sondas Elimina a necessidade de testar e otimizar ensaios no laboratório Já vem nas condições universais de construção de primers e termociclagem

41 Custom TaqMan® Gene Expression - Pesquisador envia a sequência e a empresa padroniza o ensaio, dispensando todas as validações o gasto de tempo e reagentes com padronizações. TaqMan® Gene Expression Assays - Kit pronto disponível (genes conhecidos) TaqMan® Endogenous Control - Kit pronto disponível

42 Considerações finais Custo-benefício Conhecimentos específicos Validação de resultados Interpretação estatística

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