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Discentes:Dayane Andrade dos Reis Fernanda M. de Oliveira Henriette G. Moranza Docentes: Prof.Dr.Jesus A. Ferro Prof. Dr. Marcos Tulio.

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1 Discentes:Dayane Andrade dos Reis Fernanda M. de Oliveira Henriette G. Moranza Docentes: Prof.Dr.Jesus A. Ferro Prof. Dr. Marcos Tulio

2 A genômica é a ciência que estuda o genoma dos organismos a partir do seu sequenciamento completo, com o objetivo de entender a sua estrutura, organização e função. Genômica Estrutural: determina a sequência de nucleotídeos de um genoma. Estuda a organização e estrutura dos genes, refere- se aos dados do sequenciamento de DNA; Genômica Funcional: Genômica funcional é um campo da biologia molecular que descreve a função de genes e proteínas. Basicamente, a função de um gene é determinada quando são identificados os seus respectivos produtos gênicos.

3 GENÔMICA FUNCIONAL Transcriptômica Proteômica Metabolômica RNAi Knockouts

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5 Transcriptoma ou Transcritoma refere-se ao conjunto completo de transcritos (RNAs mensageiros, RNAs ribossômicos, RNAs transportadores e os microRNAs) de um dado organismo, órgão, tecido ou linhagem celular. Para estudar o transcriptoma os pesquisadores utilizam métodos de análise em grande escala como: SAGE (analise serial da expressão gênica); Microarrays (microarranjos de cDNA); RNAseq.

6 SAGE (analise serial da expressão gênica) é uma técnica para quantificar em larga escala a expressão de genes de uma dada população de RNAs mensageiros. Esta técnica gera etiquetas (tags) de cDNA que são ligadas e seqüenciadas para, em seguida, serem analisadas e anotadas.

7 A técnica de analise em larga escala conhecida como microarrays ou chips de DNA, permite uma visão global na busca de padrões de expressão gênica em amostras biológicas; Por meio da determinação da expressão de milhares de genes simultaneamente, esta tecnologia permite a comparação entre comportamentos moleculares de diversos tipos de linhagens e tecidos diferentes;

8 RNA-Seq envolve seqüenciamento de cDNAs (DNA complementar), obtidos a partir da ação da enzima transcriptase reversa sobre RNAs mensageiros, utilizando tecnologias de seqüenciamento com alto rendimento; Permite: medição dos níveis de transcritos e determinar a estrutura funcional dos genes; Permite a quantificação dos níveis de expressão gênica, mesmo em transcritos que possuem níveis mais baixos de expressão devido a sua alta sensibilidade; Útil para descobrir novas transcrições, identificação de mutações, indels, splicing alternativos;

9 É uma maneira relativamente simples e rápida de inativar o gene e assim compreender as funções destes; Esse método explora o mecanismo natural usado em várias plantas, animais, fungos e protozoários para se proteger contra certos vírus e elementos transponíveis;

10 Introduz uma molécula dupla fita de RNA, cuja sequência de aminoácidos combina com a parte do gene a ser inativado em uma célula ou organismo; Depois que o RNA é processados ele hibridiza com o mRNA produzido pelo gene alvo e o direciona para degradação.

11 O nocaute ou inativação de um gene é uma técnica genética que consiste em bloquear a expressão de um gene específico num organismo, substituindo o gene original em seu locus por uma versão modificada do mesmo, à qual se extraiu um ou vários exões para gerar uma versão não funcional, incapaz de produzir a proteína que codificava o gene original. O objetivo desta técnica é deduzir a atividade de um gene ou o papel biológico deste, com base em um fenótipo mutante.

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13 O termo proteômica foi introduzido em 1995 para descrever todas as proteínas que são expressas em um genoma (Anderson et al., 1996; Wilkins et al., 1996); Atualmente, proteômica é descrita como um método direto para identificar, quantificar e estudar as modificações pós- traducionais das proteínas em uma célula, tecido ou mesmo organismos. Não é uma característica fixa se altera com o desenvolvimento do tecido ou sob as condições em que o indivíduo se encontra;

14 Fundamenta-se em princípios bioquímicos, biofísicos e de bioinformática para quantificar e identificar as proteínas expressas;

15 2 técnicas utilizadas para análise: Eletroforese bidimensional em gel de poliacrilamida (2DE) Separação, detecção e quantificação de proteínas Espectrometria de massa Identificação das proteínas através da bioinformática

16 Introduzida na década de 70 A 2DE combina duas técnicas de separação: a primeira separação (primeira dimensão) Focalização isoelétrica (IEF) a segunda dimensão (2DE) Eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE)

17 No IEF, as proteínas são separadas por alta tensão em um gradiente de pH imobilizado em um gel de acrilamida até alcançarem a posição estacionária, onde a carga total é zero (pI). Na 2DE, as proteínas são separadas pelo peso molecular, também através de uma tensão, em gel de poliacrilamida. Após a coloração do gel, observa-se um perfil bidimensional de pontos (spots), sendo que em cada ponto há múltiplas cópias de uma proteína. A imagem deste perfil é posteriormente analisada através da bioinformática.

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19 Algumas limitações: proteínas muito ácidas (pH menor que 3,5) ou básicas (pH maior que 9) proteínas de baixa abundância proteínas hidrofóbicas No geral, a 2DE é um método de separação eficiente, pois todas as proteínas da amostra são separadas simultaneamente, fornecendo informações úteis: pI, massa molecular, expressão, abundância relativa e modificações pós-traducionais

20 Uma das técnicas mais utilizadas para a identificação das proteínas é a análise do fingerprinting da massa precisa de um número de peptídios derivados da mesma proteína

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22 Se refere ao conjunto de todos os metabólitos que são produzidos e/ou modificados por um organismo. Compreende uma grande variedade de compostos químicos de baixa massa molecular (<1000 Da), que apresentam propriedades químicas diversas; De espécies iônicas a carboidratos hidrofílicos, álcoois e cetonas voláteis, aminoácidos e ácidos orgânicos, lipídeos hidrofóbicos e produtos naturais complexos. Os níveis dos metabólitos representam uma informação integrativa da função molecular, definindo assim o fenótipo de uma célula ou tecido, em resposta a alterações ambientais ou genéticas. A identificação desses níveis é um complemento fundamental na determinação da função gênica

23 Diferencialmente dos RNAs e proteínas, é muito difícil estabelecer ligação direta entre genes e metabólitos; Análise é mais complexa; Como um metabólito pode participar de diversas vias metabólicas e os intermediários metabólicos apresentam vida muito curta, a interpretação dos dados metabolômicos é dificultosa.

24 Envolve a determinação dos níveis ou concentrações de compostos químicos de baixa massa molecular e que estejam presentes dentro e/ou fora das células. Do ponto de vista analítico, há basicamente duas abordagens principais para a análise do metaboloma: Análise Direcionada: determinação de um grupo de metabólitos pré-definidos, ignorando outros que sejam detectados durante a análise; Perfil Metabólico: conjunto de todos os metabólitos ou produto derivado e que sejam detectáveis durante a análise, acompanhando por uma estimativa de quantidade (absoluta ou relativa).

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26 Passo 1: Interrupção rápida do metabolismo (quenching) por alterações na temperatura ou pH. Passo 2: Separação da biomassa celular do meio de cultura; Passo 3: Concentração das amostras, por extração seletiva ou evaporação a vácuo de solventes

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28 Métodos mais usados para detecção e análise: Espectrometria de massa Alta sensibilidade e praticidade, possibilidade de se confirmar identidade de componentes e identificação de compostos desconhecidos Ressonância Magnética Nuclear Util na caracterização estrutural de compostos desconhecidos. Mais caro

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30 Metagenômica: é a análise genômica das comunidades de microrganismos de um determinado ambiente por técnicas independentes de cultivo; Metagenoma: é o genoma coletivo da microbiota total, encontrada em um determinado habitat.

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32 Saúde humana

33 Bioenergia

34 Agricultura

35 Biorremediação

36 Metabolismo animal

37 Identificar genes funcionais e/ou novas vias metabólicas; Estimar a diversidade microbiana; permitindo o estudo dos genomas em uma comunidade como um todo; Compreender a dinâmica da população de uma comunidade inteira.

38 Amostras devem representar a população Quantas amostras são necessárias? Curvas de raridade para estimar fração de espécies sequenciadas. (Abundância x Complexidade). Presença de populações dominantes afeta análises representação maior e maior chance de montar contigs. Quanto mais metadados forem coletados mais detalhadas serão as inferências das condições ambientais. Ex.: dados geográficos, bioquímicos, data de coleta, métodos de extração do DNA.

39 Métodos tradicionais: Genes marcadores (16S rRNA, recA) Sequenciamento (Sanger, pirosequenciamento) Técnicas de fingerprint (T-RFLP, DGGE) Metagênomica: Melhor representação da composição taxonômica Aspectos funcionais

40 Necessidade de se obter grande número de sequências Novas plataformas de sequenciamento: 454 (Roche), SOLiD (Applied Biosystems), Genome Analyzer (Illumina) Obtenção de sequências em larga-escala Favorece estudos metagenômicos

41 Terragenome We know more about the movement of celestial bodies than about the soil underfoot. -Leonardo da Vinci

42 Global Ocean Sampling (GOS) Fonte:

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44 Genoma da Apis mellifera já sequenciado – GenBank;

45 Análise em larga escala da expressão gênica em diferentes fases do ciclo de vida da abelha; Identificação dos genes envolvidos no: Desenvolvimento de castas Ativação dos ovários em rainhas e operárias Ciclo funcional das glândulas hipofaríngeas Determinação do sexo nas fases iniciais da embriogênese

46 2 estratégias no projeto: 1) Identificação de genes candidatos no genoma da abelha a partir do conhecimento prévio da função destes genes em outros organismos, especialmente os atributos do Gene Ontology registrados no Flybase

47 2) Busca e análise de novos genes através de microarrays, por estratégias de hibridização subtrativa e pela construção de uma biblioteca de cDNA das fases embrionárias. A expressão diferencial destes genes foi avaliada e candidatos de interesse foram investigados com mais detalhe por RT-PCR quantitativa e silenciamento por RNAi. O conjunto das informações geradas foi submetido a análises de redes gênicas para revelar possíveis conexões e a organização em redes funcionais.

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