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1de18 Validação de Métodos e Instrumentos em Análise Química 6 de Novembro de 2006.

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1 1de18 Validação de Métodos e Instrumentos em Análise Química 6 de Novembro de 2006

2 2de18 Considerações Gerais sobre Validação/Qualificação (1de2) É indispensável que os trabalhos executados num laboratório mereçam confiança. Sendo qualquer actividade humana susceptível de erros, devem ser tomadas precauções para diminuir as probabilidades de que ocorram erros. Admitir-se-á que o laboratório deverá dispor de meios humanos que, além de serem em número suficiente são devidamente competentes e qualificados. Iremos discutir: –Instrumentos de medida usados em ensaios. –Sistemas de aquisição e tratamento de dados. –Métodos de ensaio.

3 3de18 Considerações Gerais sobre Validação/Qualificação (2de2) Num laboratório, tem que se assegurar que os meios materiais e humanos são adequados para a realização dos ensaios (em qualificação e número). Para efeito de exposição destes assuntos serão tratados em separado os vários componentes do Laboratório: nesta aula vamos admitir que os equipamentos do laboratório e os respectivos operadores estão qualificados para a realização dos ensaios e começaremos por apresentar e discutir a validação de métodos de análise química.

4 4de18 Validação de Métodos de Ensaio A Validação dum Método de Ensaio (de Análise) é o procedimento utilizado para provar que esse método de análise é suficientemente rigoroso para dar resultados dignos de confiança para o fim em vista. Para isso, há que verificar a conformidade do método com vários critérios para o que terá que se proceder a ensaios de forma ajustada à natureza do método e das amostras a analisar.

5 5de18 Delineamento Experimental para Ensaios de Validação Antes de começar o trabalho experimental há que ter em conta a natureza das técnicas utilizadas bem como o trabalho já realizado no desenvolvimento do método de ensaio. Vai tomar-se como exemplo um tipo de método para análise química. Para enquadrar a discussão deste assunto vai então admitir-se que se usa uma técnica cromatográfica e em que não é necessário ter preocupações com pormenores relativos às fases de amostragem, conservação de amostras e pré-tratamento das amostras a ensaiar.

6 6de18 Critérios de Validação e Adequabilidade do Método Vamos avaliar o método de análise química utilizando vários critérios mas no fim terá que ser feita uma avaliação global do método para verificar se é adequado para os fins em vista. Na realidade, um método de análise pode servir para analisar um componente duma amostra e ser inadequado para analisar outro tipo de amostra: pode considerar-se como exemplo um método de análise de ferro num minério em que o teor pode ser da ordem de 70% e, por outro lado, a análise de ferro numa água natural em que a concentração de ferro pode ser da ordem de 70ppm.

7 7de18 Selectividade/Especificidade (Interferências) Possibilidade do método fazer discriminação entre o composto que está a ser analisado e outros componentes (interferentes) eventualmente existentes na amostra a analisar. No caso de técnicas cromatográficas, esta verificação pode ser sistematizada em termos de: Factor de capacidade do componente a analisar Número de pratos teóricos da coluna cromatográfica Factores de separação Factores de resolução Assimetria do pico cromatográfico.

8 8de18 Linearidade (1de2) Como sugestão, ensaiar soluções de padrão em diferentes concentrações situadas (por exemplo) na gama de 10 a 150% da concentração que se prevê existir nas amostras. Verificar se existe uma relação linear entre os valores medidos e as concentrações: –Observar o aspecto da curva de calibração. –Cálculo de regressão linear. Prestar atenção aos resíduos (em valores relativos) e verificar se os desvios em relação à recta de mínimos quadrados são superiores a 5%.

9 9de18 Linearidade (2de2) Relativamente a este tratamento pode discutir-se: –Inclusão ou não da origem nos pontos experimentais. –No caso de haver indícios de desvios de linearidade, experimentar ajustamentos não lineares pelo método de mínimos quadrados e testar os resultados por critério estatístico (existem normas como, por exemplo, ISO Standards Compendium, First Edition, Geneva, 1994). –Muitas vezes, opta-se por estabelecer a gama de de trabalho em zona de linearidade e diluir amostras se for necessário.

10 10de18 Medição da Amplitude do Ruído Para calcular o limite de detecção interessa medir o valor da amplitude de ruído de período curto para o que há vários métodos como traçar só duas rectas paralelas ou considerar segmentos e fazer a média dos ruídos medidos para os segmentos. Em alternativa a este método pico a pico, pode usar-se método de cálculo RMS (Root Mean Square) que também existe em muitos sistemas de dados.

11 11de18 Limites de Detecção e de Quantificação. Sensibilidade do Método Limite de detecção corresponde à concentração mínima que é detectável nas condições do ensaio: –Pode considerar-se igual à concentração correspondente a 2 ou 3 vezes o ruído de período curto. Limite de quantificação corresponde à concentração mínima que é quantificável nas condições do ensaio: –Pode considerar-se igual à concentração correspondente a 10 vezes o ruído de período curto. Sensibilidade do método: declive da recta de calibração.

12 12de18 Precisão (1de2) A precisão corresponde a uma medida da concordância entre os valores obtidos por aplicação do método em análises (repetidas) para mesma amostra. Nos ensaios para estudar a precisão há várias etapas e começa-se por avaliar a Repetibilidade: resultados obtidos em sequência de análises realizadas para a mesma amostra no mesmo dia pelo mesmo operador com os mesmos reagentes e no mesmo equipamento. Se os resultados forem considerados satisfatórios, passa-se para o estudo da precisão intermédia.

13 13de18 Precisão (2de2) Para avaliar a precisão intermédia faz-se um estudo intra- laboratorial (no mesmo laboratório) em que análises da mesma amostra vão ser realizadas em dias diferentes por diferentes operadores, com reagentes de origem diferente e, eventualmente, com equipamentos diferentes. Finalmente a precisão do método terá de ser avaliada mediante ensaios inter-laboratoriais organizados por instituições dignas de confiança e em que se parte de uma quantidade suficientemente grande de amostra que é enviada a diferentes laboratórios onde vai ser analisada pelos métodos usados nesses laboratórios. No fim, é feita uma análise estatística do conjunto de resultados que é dada a conhecer aos participantes mas mantendo confidencial a identidade dos participantes.

14 14de18 Exactidão (1de2) A exactidão vai corresponder a uma medida da concordância entre o valor obtido por aplicação do método de análise e o valor verdadeiro. Modos de proceder: –São muito usados os ensaios de fortificação de amostras. Parte-se de uma amostra que não contém o composto que se pretende dosear e adiciona-se à amostra uma quantidade conhecida desse composto pelo que se fica a conhecer a respectiva concentração. Aplica-se o método de análise e compara-se o valor medido com o valor teórico. Geralmente o valor é expresso na forma de percentagem de recuperação.

15 15de18 Exactidão (2de2) –No caso de existir um método de referência, a mesma amostra é analisada pelos dois métodos e os resultados são comparados. –Havendo material de referência certificado (ou equivalente), pode analisar-se esse material pelo método que está a ser estudado e comparar o resultado obtido com o valor que consta do certificado. –A participação em ensaios de intercalibração também permite avaliar a exactidão pois quando se recebe o relatório final fica-se a conhecer um valor credível para a concentração na amostra analisada.

16 16de18 Robustez A robustez do método é uma medida da influência que pequenas variações de condições experimentais podem ter nos resultados. Para avaliar a influência de variações nos vários parâmetros, pode testar-se um a um ou então variar simultaneamente vários mas de acordo com programação cuidadosa dos ensaios. Para uso de amostradores automáticos deve ter-se em conta a estabilidade das soluções: 16 ou 64 horas.

17 17de18 Conformidade com Normas Internacionais de Validação Existem normas de validação de método bem como guias para interpretação de resultados dos ensaios de validação de que são exemplos: –USP - United States Pharmacopeia –ICH – International Conference on Harmonization. Os trabalhos de validação de métodos já se encontram facilitados por software de sistemas cromatográficos: executam automaticamente tarefas usando valores previamente especificados para os parâmetros e verificam se valores calculados estão em conformidade com os requisitos, produzem documento (relatório) e fazem registo electrónico dos resultados.

18 18de18 Considerações Finais sobre Validação de Método Pode aligeirar-se este trabalho de validação de métodos de análise se os métodos a adoptar no laboratório forem normalizados ou aceites por instituições dignas de confiança. Outra observação a fazer é que se torna necessário revalidar um método de ensaio se vão ser feitas alterações significativas no método. Como conclusão final, pode afirmar-se que não vale a pena fazer análises de rotina com método que não esteja validado.


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