A Influência da Amostragem na Determinação de Foto-pigmentos em Espectrofotometria-UV e Comparação dos Resultados à Fluorimetria Juno Morais Maíra Campos.

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1 A Influência da Amostragem na Determinação de Foto-pigmentos em Espectrofotometria-UV e Comparação dos Resultados à Fluorimetria Juno Morais Maíra Campos Marcela Ribeiro Michelle Teodoro Outubro/2006

2 Introdução A concentração de pigmentos fotossintetizantes é extensamente utilizada para estimar a biomassa do fitoplâncton. No fitoplâncton, a Clorofila-a constitui de 1 a 2% do peso seco (Barroso; Littlepage, 1998). A concentração de Clorofila-a também tem sido relacionada à produtividade primária (Wetzel, 1983), que por sua vez é importante para estimar a capacidade de suporte do sistema.

3 Objetivo Verificar a influência do volume amostral para a determinação de Clorofila-a pelo método de Lorenzen e, comparar os resultados àqueles obtidos pela sonda SCUFA.

4 O método de Lorenzen, descrito em 1967, é ainda hoje largamente utilizado. Foi primeiro oficialmente aceito para a determinação de Clorofila-a e feopigmentos; incorporou, a métodos já propostos, a acidificação durante a realização das leituras e definiu dois comprimentos de onda: 665 e 750 nm. A acidificação da amostra provoca o rompimento do anel de porfirina. A SCUFA(Self-contained Underwater Fluorescence Apparatus) é um fluorímetro submersível para medição in situ de clorofila; possui mecanismos que reduzem a influência da luz ambiente, turbidez e oscilação de temperatura. Detecta a clorofila através de um feixe de excitação azul (460 nm) e pela detecção da luz emitida pela amostra a 685 nm (vermelho).

5 Metodologia Ponto de coleta: 20º44’48,48’’S; 45º55’51,27’’W
Cidade: Guapé – MG Em: 30/09/2006. Análise: 03 e 04/10/2006 Fonte: Google Earth

6 Metodologia Foram coletados, com garrafa de Van Dorn, três volume distintos (1, 2 e 3 litros), a 1,5 m de profundidade, em triplicata; Ao mesmo tempo coletamos aproximadamente 15 minutos de dados com a sonda SCUFA; As amostras, antes de serem filtradas, foram também analisadas pela SCUFA em um béquer de 2 litros (5 minutos de dados para cada amostra); A SCUFA foi conectada a um laptop para que os dados registrados fossem recuperados em Windows Excel; Em laboratório de campo filtramos as amostras em filtro de fibra de vidro conforme o método de Lorenzen; No laboratório de Ecofisiologia de Organismos Zooplanctônicos da UFMG procedemos com a análise espectrofotométrica. O tese-t foi utilizado para comparação dos volumes amostrados (Systat)

7 Resultados Composição do fitoplâncton em função dos pigmentos
Clorofíceas Clorofila-a, ß-caroteno e luteína (xantofila) como pigmentos principais; Clorofila-b como pigmento acessório e outros carotenos e xantofilas em pequenas quantidades. Crisofíceas Clorofila-a e  ß-caroteno como pigmentos principais e outras clorofilas e xantofilas em pequenas quantidades. Bacilariofíceas Clorofila-a e ß-caroteno como pigmentos principais; fucoxantina (xantofila) como pigmento acessório e outros carotenos, clorofilas e neofucoxantinas em pequenas quantidades.

8 Scan da amostra de Clorofila
Intervalo de leitura: nm à nm Picos de absorção: 430 nm e 660 nm.

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10 teste Teste-t Variáveis 1L e 2L P valor: 0.145 Variáveis 1L e 3L

11 Discussão Na varredura das amostras, obtida pelo scan, verifica-se um pico de absorbância em 660nm e não em 663nm, como observado na literatura. Deste modo, faz-se necessário o questionamento se o método mede mesmo clorofila-a, como descrito, ou se haveria a influência de outros foto-pigmentos. Sendo assim, que pigmentos seriam estes. A análise do fitoplâncton revelou a dominância das espécies Chlorella sp., Melosira sp. e Dynobryum sp., dos grupos Clorofíceas, Bacilariofíceas e Crisofíceas respectivamente. Os pigmentos encontrados nestes organismos são predominantemente, clorofila-a, β-carotenos, que absorve em 466 nm e 496 nm, e xantofilas , o que não explica o pico de absorção em 660nm.

12 Na comparação dos dois métodos, espectrofotométrico e fluorimétrico, os gráficos mostraram uma grande discrepância, sendo os valores da fluorimetria sempre mais elevados. Estes resultados são indicativos da própria qualidade das medidas que ambos métodos possuem. A fluorimetria é um tipo de medida mais sensível e o espectrofotômetro mais específico (Dos Santos et al, 2003), assim, é de se esperar que as medidas da primeira fossem maiores. Os valores de clorofila-a nos três diferentes volumes amostrados não apresentaram diferenças significativas, verificadas pelo valor de p. No entanto, o baixo número amostral (3 pontos, com três réplicas cada) pode ser um empecilho para a aplicação eficaz de um teste estatístico. .

13 Discussão Conclusão O estudo confirmou que o volume amostrado não influencia no resultado do método de Lorenzen, refutando a hipótese de que um maior volume filtrado aproximaria o resultado dos dois métodos. Sugere-se uma varredura prévia das amostras para estudos de localização no scan de picos de absorção; Baseado na tendência dos gráficos parece não existir correlação entre os dois métodos: espectrofotométrico e fluorimétrico; A fluorimetria é um tipo de medida mais sensível e o espectrofotômetro mais específico (Dos Santos et al, 2003).

14 Referências Barroso, G.F; Littlepage, J Protocolo para análise de clorofila a e feopigmentos pelo método fluorimétrico. BMLP – Vitória – ES. Chlorophyll and phaeophytin determination (Spectrophotometric Method). Disponível em: < Acesso em: 05 de outubro de 2006. Dere, S; Günes, T; Sivaci, R Espectrophotometric determination of chlorofyll – A, B and total carotenoid contents of some algae species using diffrent solvents. Tr. J. of botany, f Dos Santos, A.C.A., Calijuri, M.C., Moraes, E.M., Adorno, M.A.T., Falco, P.B., Carvalho, D.P., Deberdt, G.L.B. & Benassi, S.F. Comparison of three methods for Chlorophyll determination. Disponível em: < Acesso em: 23 de setembro de 2006. Lorenzen, C.J Determination of chlorophyll and pheo-pigments: espectrophotometric equations. Limnol. Oceanogr., 12: Performance verification statement for the turner designer SCUFA fluorometer. Disponível em: < Acesso em : 10 de outubro de 2006. SCUFA - Self-Contained Underwater Fluorescence Apparatus. Disponível em: < Acesso em: 10 de outubro de 2006. Software Estatístico: Systat Version 5.0. Copyright, Systat, Inc. The Great North American Secchi Dip-In (Chlorophyll Analysis). Disponível em: < Acesso em 05 de outubro de 2006. Wetzel, R.G Limnology. 2nd edition. Saunders College Publishing, Philadelphia, PA.