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Controle do Crescimento Microbiano
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1. Introdução 1.1. Quais os principais fatores limitantes para o crescimento microbiano? Temperatura pH Disponibilidade de H2O Disponibilidade de O2 1.2. Uso dos agentes de controle - estudos com microrganismos ou sua aplicação - evitar infecções - evitar a decomposição de materiais
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2. Fundamentos e Conceitos do Controle Microbiano
Fundamentos do controle de microrganismos - Morte de uma população microbiana * Conceito de morte em Microbiologia * Percepção da morte - Inibição do Crescimento * controle dos microrganismos, limitando o seu crescimento Alguns Conceitos Importantes - Esterilização – morte ou eliminação de todos os organismos viáveis presentes em um meio de cultura - Descontaminação – tratamento de um objeto ou superfície de modo a torná-los seguros à manipulação - Desinfecção – direcionada contra os patógenos, embora possa não eliminar todos os microrganismos
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Condições que Afetam a Atividade de um Agente de Controle Microbiano
* tamanho da população * intensidade ou concentração do agente * tempo de exposição * temperatura do ambiente * natureza do meio: umidade, pH... * tipo de microrganismo**
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Influência do Tamanho Inicial da População sobre a Efetividade de um Agente de Controle
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Influência da Concentração de Fenol sobre o Crescimento da Escherichia coli
Fenol a 35 °C Cortesia da Universidade de Cambridge
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Influência do Aumento da Temperatura Sobre o Crescimento da Escherichia coli Exposta a Fenol
Cortesia da Universidade de Cambridge
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3. Tipos de Agentes de Controle e Mecanismos de ação
3.1. Controle Antimicrobiano por Agentes Físicos - Esterilização pelo calor - Esterilização por radiação - Esterilização por filtração 3.2. Controle Antimicrobiano por Agentes Químicos - Agentes químicos de uso externo 3.3. Agentes Antimicrobianos Utilizados In vivo Fármacos antimicrobianos sintéticos Antibióticos Fármacos antifúngicos Fármacos antivirais
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3.1. Controle Antimicrobiano por Agentes Físicos
Calor Úmido * desnaturação de proteínas e enzimas a) Água fervente (100 ºC) - células vegetativas x esporos b) Sob pressão (autoclavagem) – 121 °C a 1,1 kg cm-2 - rápido aquecimento - grande penetração c) Pasteurização 1860: Louis Pasteur/vinho 62,8 ºC/30 min ou 72 ºC/15 s
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Medida da Esterilização pelo Calor
Efeito da temperatura na viabilidade de uma bactéria mesofílica Fonte: Madigan et al., Microbiologia de Brock
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Relação Entre Temperatura e Tempo de Morte em Mesófilos e Termófilos
Fonte: Madigan et al., Microbiologia de Brock
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Autoclave Fonte: Madigan et al., Microbiologia de Brock
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Ciclo Típico de Autoclavagem
Fonte: Madigan et al., Microbiologia de Brock
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3.1. Controle Antimicrobiano por Agentes Físicos
Calor Seco * Oxidação dos constituintes orgânicos * Menor eficiência que o calor úmido a) incineração: eliminação de contaminantes e cadáveres, esterilização da alça de platina b) forno de Pasteur * 160 ºC durante 2 h Baixas Temperaturas * preservação de alimentos, drogas * inibição das reações metabólicas * formação de cristais de gelo (congelamento) * redução da água disponível
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Tempo necessário para matar endósporos bacterianos pelo calor
Calor úmido Calor seco Espécie Temp ºC Tempo Temp ºC Tempo (min) (min) Bacillus anthracis >180 180 3 Clostrid. botulinum C. perfringens 120 1 C. tetani
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3.1. Controle Antimicrobiano por Agentes Físicos
Radiações * Energia eletromagnética: raios cósmicos a ondas de rádio * Energia inversamente proporcional ao a) ionizante: raios gama, raios-X, feixes de elétrons: *ionização das moléculas ex. H2O OH* (hidroxil) + e- + H+ Poderoso oxidante * alto poder de penetração b) não ionizante: * luz ultravioleta: 136 a 400 nm (** 260 nm) * excita os elétrons produzindo vários tipos de reação: DNA (mais afetado): dímeros de pirimidina * baixo poder de penetração
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Capela de fluxo laminar com uma fonte de radiação ultravioleta (lâmpada de vapor de mercúrio) utilizada para a descontaminação das superfícies internas
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Sensibilidade de Microrganismos e de Funções Biológicas à Radiação
Gray (Gy) é uma unidade do Sistema Internacional de medidas, que representa a quantidade de energia de radiação ionizante absorvida (ou dose) por unidade de massa, onde: 1 Gy = 1kg.m-2 s-2 ou 1 J kg-1 O nome da unidade é em homenagem a Louis Harold Gray (1905–1965), um radiologista britânico.
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3.1. Controle Antimicrobiano por Agentes Físicos
Filtração ** * Chamberland (1884): primeiro filtro bacteriológico de porcelana para água * Modernos: membranas de ésteres de celulose - 150 m de espessura - poros uniformes - diâmetro variável - descartáveis * ex. filtros HEPA (high efficiency particulate air): acetato de celulose dobrado ao redor de folhas de alumínio: retém 99% da matéria particulada
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Filtros HEPA Utilizados em Câmaras de Fluxo Laminar
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Unidades de Membranas Filtrantes Descartáveis, Pré-Esterilizadas e Montadas
Fonte: Madigan et al., 2004, Microbiologia de Brock
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Filtros Microbiológicos
Filtro de profundidade (Fibras de papel ou de borossilicato) Membrana Filtrante (Acetato de celulose, nitrocelulose ou polissulfona) Filtro Nucleoporo (Filmes de policarbonato) Fonte: Madigan et al., Microbiologia de Brock
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Micrografia Eletrônica de Varredura de Bactérias e Algas Aquáticas Retidas em um Filtro Nucleopore
Fonte: Madigan et al., Microbiologia de Brock
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Agentes Químicos
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3.2. Controle Antimicrobiano por Agentes Químicos
Esterilizantes a) Óxido de etileno * ativo contra células vegetativas e endósporos * alta penetração, mas necessita longa exposição * líquido abaixo de 10,8ºC, acima disso é um gás * inativação das proteínas com H lábil (-SH, -NH) H2C-CH2 + R-SH R-S-CH2CH2O-H O (inativação) b) Alquilantes (alquilação de proteínas: cross-link) * -propionolactona * Glutaraldeído * Formaldeído (formol)
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3.2. Controle Antimicrobiano por Agentes Químicos
Desinfetantes a) Fenóis (ácido carbólico): primeiro agente químico usado para o controle * Joseph Lister (1865): efetivo agente antisséptico em hospitais * solução a 5% mata células vegetativas, mas não os endósporos *COEFICIENTE DE FENOL Joseph Lister Fenol
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Meio de crescimento Série de diluições do desinfetante X
Série de diluições de fenol 0,5 ml ,5 ml Suspensão bacteriana 5 min 10 min 15 min Meio de crescimento
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Método do Coeficiente de Fenol para
Testar Desinfetantes
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3.2. Controle Antimicrobiano por Agentes Químicos
Desinfetantes a) Fenóis (ácido carbólico): primeiro agente químico usado para o controle * Joseph Lister (1865): efetivo agente antisséptico em hospitais * solução a 5% mata células vegetativas, mas não os endósporos *COEFICIENTE DE FENOL Joseph Lister b) Álcoois * Etílico a 60-85%: mata células vegetativas * Metanol: mais eficiente porém muito tóxico * Desnaturação de proteínas * Dissolvem os lipídeos da membrana Fenol
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3.2. Controle Antimicrobiano por Agentes Químicos
c) Halogênios: iodo, cloro, bromo * iodo e compostos relacionados: agente oxidante, combina-se com a tirosina, inativando proteínas * cloro: formação de ácido hipocloroso liberando radicais de oxigênio d) Metais pesados: chumbo, zinco, prata, cobre, mercúrio * combinam-se com proteínas, provocando sua inativação ex. SH S enzima + HgCl2 enzima Hg + 2HCl
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3.2. Controle Antimicrobiano por Agentes Químicos
e) Detergentes * desnaturação das membranas - Aniônicos: [C9H19COO]-Na+ [C12H25OSO3]-Na+ (sabão) (Dodecil sulfato de sódio) - Catiônicos: Cloreto de amônio Cloreto de cetil piridinium - Não iônicos: octoxinol
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Agentes Antimicrobianos
Utilizados In vivo
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3.3. Agentes Antimicrobianos Utilizados In vivo
- A maioria dos agentes físicos é muito drástica e a maioria dos agentes químicos é muito tóxica para uso interno em humanos - Mesmo antissépticos moderados podem ser aplicados somente sobre a pele Diferentes tipos de fármacos antimicrobianos são produzidos continuamente pela indústria farmacêutica... - Os fármacos antimicrobianos são classificados de acordo com sua estrutura molecular, seu mecanismo de ação e seu espectro de atividade antimicrobiana - Categorias de fármacos antimicrobianos: Agentes sintéticos Antibióticos
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3.3. Agentes Antimicrobianos Utilizados In vivo
Fármacos antimicrobianos sintéticos Salvarsan * uso do arsênico para tratamento da sífilis: até 1900 (muito tóxico) * estudos iniciais sobre coloração de microrganismos * corantes seletivos: não colorem células animais * primeiro agente quimioterápico: composto orgânico com arsênio * Paul Erlich - Prêmio Nobel 1908 Paul Erlich Salvarsan Fonte: Madigan et al., Microbiologia de Brock
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3.3. Agentes Antimicrobianos Utilizados In vivo
Fármacos antimicrobianos sintéticos Sulfonamidas * Gerhard Dogmagk da Bayer (1935): teste com corantes orgânicos sintéticos contra estreptococos: Prontosil *Jacques Tréfouël: Sulfanilamida: análogo estrutural do PABA (ác. p-aminobenzóico) - PABA: formação de ác. tetrafólico, coenzima (síntese de timidina e aminoácidos) - Seres humanos não usam PABA, sintetizam o THFA a partir do ác. fólico dos alimentos * 1945: milhares de derivados: SULFONAMIDAS (c) Ácido fólico
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Fatores de Crescimento e Análogos Antimicrobianos
Fonte: Madigan et al., Microbiologia de Brock
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3.3. Agentes Antimicrobianos Utilizados In vivo
Antibióticos - Definição: Agentes antimicrobianos produzidos por microrganismos (bactérias e fungos) exibindo função de inibir ou matar outros microrganismos Ganhadores do Premio Nobel em Fisiologia e Medicina de 1945 “Descoberta da Penicilina e seus efeitos curativos em várias doenças infeciosas" Sir Alexander Fleming Ernst B. Chain Sir Howard Florey
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3.3. Agentes Antimicrobianos Utilizados In vivo
Antibióticos - Espectro de ação: * Largo espectro (ex: Tetraciclina) * Baixo espectro (ex: Vancomicina)
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Produção e Utilização Anual de Antibióticos no Mundo
* * * * * Antibióticos B-lactâmicos Fonte: Madigan et al., Microbiologia de Brock
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Principais Agentes Antimicrobianos de Procariotos
Antibióticos -lactâmicos: * Principais representantes: penicilinas e cefalosporinas * 50% dos antibióticos produzidos mundialmente * Produtores: Penicillium chrysogenum: penicilina Cephalosporium spp.: cefalosporina * Inibem a síntese de peptidoglicano (transpeptidação) * Provocam a liberação de autolisinas: digestão da parede já existente * Espectro: ativos contra bactérias Gram positivas * Aparecimento de resistência: produção de B-lactamases
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Principais Agentes Antimicrobianos de Procariotos
Antibióticos Aminoglicosídeos: * Aminoaçúcares unidos por ligações glicosídicas * Principal representante: Estreptomicina (produzida por Streptomyces griseus) * Ação: inibição da síntese de proteínas (ligação com a subunidade 30S) * Espectro: ativos contra G- e G+, usados clinicamente contra Gram negativos * Efeitos colaterais: afetam o sistema nervoso * Rápido aparecimento de cepas resistentes * Apenas 3% do total produzido * Antibióticos de reserva
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Principais Agentes Antimicrobianos de Procariotos
Antibióticos Macrolídeos: * Grande anel lactona conectado com açúcares * Principal representante: Eritromicina (produzida por Streptomyces erythreus) * Ação: inibição da síntese de proteínas: combina-se com a subunidade 50S ribossomal, impedindo a polimerização * Ativos contra bactérias Gram + e Gram - * Usado em substituição à penicilina para pacientes alérgicos Eritromicina Fonte: Madigan et al., Microbiologia de Brock
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Mecanismos de Ação de Alguns dos Principais Agentes Antimicrobianos de Procariotos
Síntese Protéica (inibidores de 50S) Eritromicicina (macrolídeo) Síntese Protéica (inibidores de 50S) * Principais alvos: - Parede celular - Membrana plasmática - Processos biossintéticos: síntese de proteínas síntese de ác. nucléicos Fonte: Madigan et al., 2010
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3.3. Agentes Antimicrobianos Utilizados In vivo
Fármacos Antifúngicos * Apresentam problemas para o desenvolvimento de quimioterápicos * Muitos fármacos antifúngicos podem ser utilizados apenas em aplicações tópicas (superfície) * Alguns apresentam toxicidade seletiva: afetam estruturas ou processos metabólicos específicos dos fungos * Principais representantes: Polienos (Streptomyces nodosus; S. nursei) Azóis (fármacos sintéticos)
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Mecanismos de Ação de Agentes Quimioterápicos Antifúngicos
Fonte: Madigan et al., Microbiologia de Brock
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3.3. Agentes Antimicrobianos Utilizados In vivo
Fármacos Antivirais Controle de vírus * a condição de parasita intracelular obrigatório - íntima ligação com as funções da célula hospedeira - dificuldade de controle a) Análogos de Nucleosídeos * AZT (Zidovudine): análogo estrutural da timidina: bloqueia a síntese de DNA intermediário dos retrovírus (transcriptase reversa) * Aciclovir: inibe o alongamento do ácido nucleico viral b) Neviparina: liga-se à transcriptase reversa, inibindo sua ação c) Rifamicina: inibe a RNA polimerase
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3.3. Agentes Antimicrobianos Utilizados In vivo
Fármacos Antivirais Interferon: * substâncias antivirais produzidas por células animais * proteínas de baixo PM * inibem a multiplicação dos vírus por estimular a produção de proteínas antivirais * ligação a receptores de células não infectadas * específicos para cada tipo de célula e não de vírus * eficientes para vírus de baixa virulência * sua produção é induzida pelo vírus, pelo ácido nucleico viral ou pelo vírus inativado por radiação
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Drogas Antivirais Criadas por Computador
Drogas antivirais geradas por computador. Inibidores de proteases virais Fonte: Madigan et al., Microbiologia de Brock
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Aparecimento de Resistência a Drogas Antimicrobianas em Alguns Patógenos Humanos
* * * * Apresentam linhagens que não podem ser controladas com os fármacos atualmente conhecidos Fonte: Madigan et al., Microbiologia de Brock
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Aparecimento de Resistência a Drogas Antimicrobianas
Neisseria gonorrhoaea Surgimento de bactérias resistentes às drogas antimicrobianas. (a) relação entre o uso do antibiótico e a porcentagem de bactérias resistentes; (b) porcentagem de casos relatados de gonorréia causada por linhagens resistente às drogas Fonte: Madigan et al., Microbiologia de Brock
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Avaliação da Sensibilidade a Antibióticos por Métodos de Diluição
Fonte: Madigan et al., Microbiologia de Brock
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Teste de Difusão em Discos - Antibiograma
Padrões definidos pelo Instituto de Padrões Clínicos e Laboratoriais (CLSI) Fonte: Madigan et al., 2010
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